草鱼肠道组织消减cdna文库的构建与免疫相关基因的克隆和表达分析

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1、湖南农业太幸博士擘值论丈草鱼肠道组织消减cDNA文库的构建及免疫榍关难W的克降’，表达分析中文摘要草鱼肠道组织消减cDNA文库的构建及免疫相关基因的克隆与表达分析鱼类生活在一个水体环境，其大面积的黏膜是病原感染鱼类时最先接触的部位，它们产生的黏膜免疫反应是鱼类参与免疫应答过程的一个重要组成部分。本研究通过人工灌注嗜水气单胞菌，采用抑制性消减杂交(SSH)的方法构建了草鱼肠道组织差异表达消减cDNA文库，并对cDNA文库克隆进行了部分测序，测序结果进行了同源性搜索和功能的分类。同时，对参与肠道组织免疫相关因子组织相容性复合物(MHC—11

2、Ⅱ)、Alpha-I．微球蛋白／bulinin前体蛋白基因的cDNA全长进行克隆、序列分析，探讨了它们在草鱼不同组织中的表达分布。这些阶段性研究为进一步研究、阐释鱼类黏膜免疫机制积累了重要材料。本文的研究内容和结果主要包括以下几个方面：1．消减eDNA文库构建及其序列分析采用抑制性消减杂交技术，构建了草鱼肠道组织在细菌诱导条件下和未诱导条件下，两个不同生理状态的消减cDNA文库，随机挑取211个cDNA克隆进行了单向测序，共获得有效cDNA序列147个。序列同源性搜索结果显示，在147个有效cDNA序列中，有97个克隆与GcnBank中

3、的已知功能序列具有较高的同源性，其中包含28条MHC类EST序列；17个与未知功能的序列有一定的同源性；33个序列在Blast搜索中没有找到任何对应的相似序列，可能是没有鉴定的EST。97个已知功能的EST分别属于46个不同的基因。根据Adams对功能基因的分类方法，所获得EST分为8类，蛋白质与基因表达、信号传导、细胞结构与运动、代谢、细胞防御、细胞分裂和其它未知功能的蛋自，在本实验获得的EST分类，细胞防御类cDNA序列所占比例最高，为序列总数的27．2％，其次为信号传导和代谢，分别为12．9％、12．2％，蛋白质与基因表达为11．

4、6％。细胞结构与运动、细胞分裂两者所占比例相对偏低，说明在外源刺激的条件下，肠道组织细胞的防御、信号传导、代谢、蛋白质与基因表达相关因子都有一定的表达上调，特别是与防御相关因子。湖南农业走学博士擘位论丈学鱼肠道组织消减eDNA空库的构建及免疫相关皋州的免隆’j表达分析2．草鱼肠道免疫相关基因MHC．II旺的eDNA的克隆及序列分析根据草鱼消减文库获得的EST序列(GenBankAceNo：EW688194)设计特异性引物，分别用5'-RACE和3'-RACE的方法获得MHC—lIot基因的全长eDNA序列(GenBankAecNo：EU

5、l86148)。采用生物信息学分析了MHC．IIⅡ基因cDNA序列的结构组成特点，结果表明，所获得的MHC．IIa基因eDNA全长为1007bp，开放阅读框长度为717bp．可编码238个氨基酸；5’菲翻译区34bp，3’非翻译区256bp；在nt962—967有一个AATAAA加尾信号。由MHC—IIct基因eDNA推断的氨基酸序列编码蛋白的等电点为4．92，分子量为26．4KDa。在序列的前部分存在一个由20个氨基酸组成的信号肽，在第210．232位存在一个跨膜区。氨基酸序列比较结果，草鱼MHC．IIn氨基酸序列与鲤鱼MHC—IIa

6、相似性最高，其次为斑马鱼，与比较的序列中的护士鲨相似性最低。系统进化聚类分析研究表明，草鱼与鲤鱼、斑马鱼进化亲缘关系最近，与护士鲨、非洲鲷亲缘关系较远。RT-PCR半定量分析组织中的表达分布，诱导后结果显示，MHC．IIa在脾脏、头肾、后肠有较高的表达，在肝脏表达较低，在肌肉中几乎不表达。3．草鱼肠道组织免疫相关基因Alpha-l-microglobullingprecursor,AMBP全长eDNA克隆与序列分析根据草鱼消减eDNA文库获得的EST序列(GenbankAceNo：Ew688152)为基础设计特异性引物，采用5’RACE

7、和3’RACE方法，经拼接获得AMBP基因全长eDNA序列(GenbankAecNo：EUl86151)。AMBP基因eDNA全长序列为1230bp。开放阅读框为1047bp，可编码349个氨基酸。eDNA序列组成上，在3’端存在2个不稳定的信号ATTFA和一个加尾信号AATAAA。生物信息学方法对AMBP基因eDNA分析表明，AMBP编码的蛋白质等电点为6．27，分子量为38．84KDa。在AMBP中存在一个由18个氨基酸组成的信号肽，但没有预测到跨膜区域。经Swiss．Model预测发现AMBP的空间结构由两个不同的结构域组成，一个

8、属于lipocalin家族蛋白的伽1．微球蛋白，一个为胰蛋白酶抑制卉时(Bikunin)。经ClustalW同源性序列比较发现，AMBP氨基酸序列在相近物种中具有较高的保守性。系统进化树明显分为二大支，草鱼