南瓜蛋白诱导k562细胞凋亡的分子机制及协同sti571抗k562细胞作用的研究

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1、福建医科大学大学博士研究生学位论文南瓜蛋白诱导K562细胞凋亡的分子机制及协同STl571抗K562细胞作用的研究博士研究生：孙建成导师：黄自强教授摘要药物治疗是恶性肿瘤的三大疗法之一。近年来，诱导凋亡和分化疗法为肿瘤的药物治疗开辟了新的途径，也取得了一定成效，但仍缺乏理想的诱导凋亡和分化的药物。对天然活性物质进行抗肿瘤作用的研究，尤其在诱导凋亡和分化方面进行探索，将有助于获得理想的抗肿瘤药物。植物来源的核糖体失活蛋白(ribosome-inactivatingproteins，RIPs)具有抗生育

2、、抗病毒和抗肿瘤等多种生物学活性，其抗肿瘤活性尤其受到关注。南瓜蛋白(Cucurmosin)是本课题组从南瓜的瓜瓤中提取的一种新的RIP，本文将对其体内外抗肿瘤活性及抗肿瘤机制进行研究，旨在为其潜在的抗肿瘤临床应用提供理论基础和实验依据。一、Cucurmosin体内外抗肿瘤活性及诱导K562细胞凋亡的研究体外试验(invitro)结果表明，Cucurmosin对人慢性粒细胞白血病细胞株K562和小鼠黑色素瘤细胞株B16具有较强的杀伤作用，呈明显的量效和时效关系。MTT法检测表明，阳性对照药天花粉蛋白

3、(TCS)抑制K562细胞增殖的IC50值比Cucurmosin大4倍多，提示Cucurmosin对肿糟细胞的体外杀伤作用强于TCS。体内试验(invivo)结果表明，Cucurmosin对小鼠B16黑色素瘤和Lewis肺癌移植性实体瘤具有明显抑制作用，作用呈剂量依赖性。对B16黑色素瘤和Lewis肺癌的最大抑瘤率分别为55．2％和65．5％。用药期间未观察到明显的毒性作用，说明Cucurmosin具有良好的体内抗肿瘤活性。以K562细胞作为研究对象，观察Cucurmosin促凋亡作用。形态学观察(

4、AO／EB荧光双染法、电镜超微结构观察)发现，K562细胞出现染色质浓福建医科大学大学博士研究生学位论文集、核固缩、核碎裂及凋亡小体等典型的凋亡形态学改变；DNA琼脂糖电泳显示DNA有特征性“梯级”断裂；流式细胞仪DNA倍体分析检出典型的亚二倍体(sub—G1)凋亡峰。Cucurmosin(2．5pg／m1)作用24h、48h和72h，凋亡率分别为17．2％、35．5％和47．9％，呈明显的时间依赖性。上述结果充分说明，Cucurmosin具有诱导K562细胞凋亡的作用。二、Cueurmosin诱导

5、K562细胞凋亡分子机制的探讨K562细胞是一种人慢性粒细胞白血病(cML)细胞株，对化疗药物诱导的细胞凋亡具有很强的抵抗性，而抗凋亡机理主要与其P210kr／曲1蛋白具有很强的酪氨酸激酶(tyrosinekinase，TK)活性有关。通过抑制bcr／abl融合基因表达或下调P210吣吨”蛋白水平，或拮抗其TK活性，将有效促进K562细胞凋亡。Westernblot结果显示，Cucurmosin显著下调K562细胞P210№““蛋白水平，呈明显的时间和浓度依赖性。RT-PCR结果显示，Cucurmo

6、sin对K562细胞bcr／ablmRNA表达无明显影响。热休克蛋白90(Hsp90)是P210吣柏”蛋白的分子伴侣(molecularchaperone)，对P210k‘协1蛋白具有保护作用。Westernblot结果显示，Cucurmosin下调K562细胞Hsp90表达，这将促使P210吣山”蛋白降解。因此，我们推测Cucurmosin下调P2106州861蛋白水平与其具有核糖体失活活性及下调Hsp90表达有关。已知促凋亡因子诱导肿瘤细胞凋亡的信号通路主要有两条：死亡受体激活通路和扰乱线粒体功

7、能通路。我们研究发现，K562细胞在Cueurmosin作用下线粒体跨膜电位(△v。)呈时间依赖性下降，同时胞浆Cyt．c浓度明显上升，caspase一3被活化，说明Cucurmosin可通过干扰线粒体功能促使K562细胞凋亡。在线粒体凋亡通路中，Bcl．2家族起着重要的调控作用。Westernblot结果显示，Cucurmosin下调K562细胞抗凋亡蛋白Bcl．xL表达，同时上调促凋亡蛋白Bax表达。此外，Westernblot结果显示，Cueurmosin下调c．Myc表达，作用呈时间依赖性。

8、三、Cucurmosin与STl571的体外联合抗K562细胞作用Cucurmosin可下调K562细胞P210k临‘蛋白水平，STl571对K562细胞P210”“”的酪氨酸激酶(TK)活性具有竞争性抑制作用，提示两药通过不2福建医科人学大学博上研究生学位论文同方式对K562细胞P210吲曲1的TK活性将产生双重抑制作用。因此，我们推测两药具有协同抗K562细胞的作用。MTT法显示，Cucurmosin与STl571合用对K562细胞增殖的抑制率大于两药相应浓度单独