汉坦病毒结构蛋白基因的克隆、序列分析和表达研究

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1、山东大学博士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：豳洼纽日期：垫翌：兰：兰2关于学位论文使用授权的声明本人同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的印刷件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可

2、以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：啕堡堑导师签名：始山东大学博士学位论文汉坦病毒结构蛋白基因的克隆、序列分析和表达研究专业：流行病与卫生统计学博士生：陶泽新导师：王志玉教授中文摘要汉坦病毒(hantavirus，HV)属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)汉坦病毒属。在临床上引起肾综合征出血热(hemorrhagicfeverwithrenalsyndrome，HFRS)和汉坦病毒肺综合征(hantavimspulmonarysyndr

3、ome，HI'S)。汉坦病毒共有30多种基因型和血清型，但中国目前为止仅发现汉滩型(Hanlaan，HTN)、汉城型(Seoul，SEO)和普马拉型(Puumala，PUU)，均为HFRS的病原体。HFRS临床上以发热、出血和肾损害为主要特征，它包括朝鲜出血热、流行性出血热和流行性肾病，每年在欧洲和亚洲有近10万病例发生。较早的报道可追溯到苏联在1913和1932年，日本军队1932年在满洲里，瑞典在1934年的暴发流行。自从1978年李镐汪等从疫区的黑线姬鼠肺组织中分离到汉坦病毒76-118株以来，各国学者

4、相继分离到不同型别的汉坦病毒。引起HFRS的汉坦病毒包括HTN型、SEO型、多不拉伐一贝尔格莱德型(Dobrava，DOB)和PUU型，分别引起重度、中度和轻度的临床症状。1993年ItPS首先在美国的四角地区暴发，临床上早期出现发热、寒战等前驱症状，然后是突发性的呼吸困难，严重者导致死亡，病死率高，震惊了美国的公共卫生官员和病毒学家。研究表明该病毒病原为SN型汉坦病毒，由鹿鼠携带，随后又从不同地区的HPS病人体内分离到NY、BCC、BAY、AND等不同型别汉坦病毒。在我国尚未有HPS病例的报道。各种鼠类是汉

5、坦病毒重要的宿主和传染源，他们各自携带不同的型别汉坦病毒。携带HTNV的黑线姬鼠主要在东亚和东欧，携带DOBV的黄颈喉姬鼠出现在南斯拉夫及邻近地区，携带PUUV的欧洲棕背鼠存在于西北欧地区，而由褐家鼠携带的SEOV在世界范围内广泛存在。7山东大学博士学位论文汉坦病毒引起的HFRS在我国发病率高，是重点防治的传染病之一。中国HFRS病人总数占世界发病人数的90％以上，每年新发病例数4～6万。而山东省是HFRS的高发省份，年发病人数在我国常年位于前3位，2003年前则为全国第一位。山东省己发病例数占全国总病例数的

6、1／3。可见山东省防治HFRS的工作具有极为重要的现实意义。山东引起HFRS的汉坦病毒以SEO型为主，也有HTN病毒存在，是混合疫区。对HFRS的诊断和防治归根结底取决于对其病原学的研究进展，包括病毒分离、病毒基因及蛋白质的结构与功能的研究、分子流行病学、新型疫苗、新型诊断试剂的研究与开发等，其中对汉坦病毒的基因进行分析和分子流行病学研究又是最根本和最基础的研究。而山东省分离全片段测序的病毒株太少，对它们的分子生物学性质尚缺乏深入研究。汉坦病毒颗粒为圆形或卵圆形，外层是包膜，表面有突起，由G1和G2糖蛋白(g

7、lycoprotein，GP)组成。包膜内为病毒核酸、核衣壳蛋白(nucleocapsidprotein，NP)和RNA聚合酶组成的核衣壳，病毒体中核衣壳蛋白成分很高。病毒基因组为单股负链RNA，由长(L)、中(M)、短(s)三个节段组成，分别编码依赖RNA的RNA多聚酶，G1和G2包膜糖蛋白和核衣壳蛋白。G1、G2包膜糖蛋白对病毒的致病性起重要作用，包含了病毒的中和抗原位点、受体结合位点、融合肽和血凝位点。M片段中G1、G2的编码顺序为NH2．G1．G2．COOH。M片段首先编码产生一个126kD的糖蛋白前

8、体(glycoproteinprecursor，GPC)，然后在翻译的同时被细胞内的信号肽酶切割成G1、G2两个蛋白，组成异二聚体表达在内膜系统，部分转运至细胞膜表面，切割位点为一段绝对保守的WAASA的氨基酸序列。G1、G2共表达是二者在胞内有效转运和行使功能的基础。G1、G2富含半胱氨酸残基，维持了异源二聚体在内膜系统管腔内高度有序的空问结构。G1、G2蛋白共有5～7个N一连糖基化位点，在二聚体