rna干扰抑制乙型肝炎病毒抗原表达的实验研究

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1、重庆医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。学位论文作者签名：三墨：—二!遁：一一日期：—上立垒丘：jL塑学位论文版权使用授权书本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在

2、攻读学位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或帮分内容(保密内容除外)，可以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：指导教师签名：日期：丛丛6：笙!翻重庆医科大学硕士研究生学位论文英文缩写bpcDNACMVDNADABDEPCDMSODNAdNTPHBVHBeAgHBsAgHICCLBMCSM匠IAmlnmRNAmPBSPCRPEGPTGSRNA符

3、号说明英文全称basepaircomplementaryDNAeytomgalovirusdeoxyribonucleicaciddiasecobenzidinediethylpyrocarbunateDimethylsulfoxidedeoxyribonucleicaciddexyribonucleosidetriphophatehepatitisBvirushepatitisBviruseantigenhepatitisBvirussurfaceantigenhourimmunocytotochemistrylufia．bertai

4、nmediummultiplecloningsitemicroparticleenzymeimmunoassayminutemessengerRNAnucleotidephosphatebufferedsolutionpolymerasechainreactionPolyethyleneGlycolposttranscriptiongenesilencingribonucleicacid中文全称碱基对互补DNA巨细胞病毒脱氧核糖核酸二氨基联苯氨焦碳酸二乙脂二甲基亚砜脱氧核糖核酸脱氧核苷三磷酸乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒e抗原乙型肝炎病毒表面

5、抗原小时免疫细胞化学LB培养基多克隆区微粒子酶免疫实验分钟信使RNA核苷酸磷酸盐缓冲液聚合酶链反应聚乙二醇转录后基因沉默核糖核酸重庆医科大学硕士研究生学位论文RNAirpmRT-PCRSecshRNAsiRNARNAinterferencerollsperminutereversctranscriptionPCRsecondshorthairpinRNAsmallinterfereneRNA2RNA干扰每分钟转数逆转录PCR秒钟短发夹鼬姐小干扰RNA重庆医科大学硕士研究生学位论文RNA干扰抑制乙型肝炎病毒抗原表达的实验研究摘要目的及意义

6、：构建哺乳动物shRNA表达载体，观察shRNA表达载体在细胞水平和机体水平对HBV抗原表达的抑制作用，为应用RNAi技术治疗乙型肝炎奠定一定的基础。方法：本研究将已构建好的I-IBV真核表达载体pHBVl．5，通过限制性内切酶，PCR鉴定确认正确后，转染Hela细胞。用RT-PCR检测皿vCmRNA转录；免疫细胞化学检测HBeAg前体的表达；MEIA分别检测培养上清和细胞裂解液qbHBsAg和HBeAg的表达水平；明确pHBVl．5在Hela细胞中的表达。采用基因重组方法将体外化学合成靶向HBVpreC／C基因的shRNA转录模板的D

7、NA序列克隆到含有人U6启动子的载体pTZU6+I中。通过限制性内切酶，测序对构建的载体进行鉴定确认后，将pHBVl．5与已构建好的shRNA表达载体以不同比例分别共转染Hela细胞，72h后，用半定量PCR和MEIA分别分析shRNA表达载体对HBVCmRNA和HBsAg、HBeAg的抑制情况。再将pHBVl．5以水动力学方法快速(10秒之内)高负荷(2．5ml／只)注射Balb／cdx鼠尾静脉，注射后第6天，分别检测小鼠血清中HBsAg、HBeAg的表达水平；同时取小鼠肝脏组织，用RT-PCR检NHa3VCmRNA的表达，以确认小鼠

8、急性乙型肝炎病毒感染模型的建立。最后将pHBVl．5与前面体外实验筛选到的干扰作用最强的一个shRNA表达载体(psiHBVl)同样以水动力学方法快速高负荷地共注射Balb／cd、鼠尾静脉，同样于注射后第6