cyr61在肝脏祖细胞增殖中的作用及其与肝癌关系的研究

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1、第三军医大学博士学位论文Cyr61在肝脏祖细胞增殖中的作用及其与肝癌关系的研究姓名：丁伟申请学位级别：博士专业：临床检验诊断学指导教师：马维柯2012-11第三军医大学博士学位论文Cyr61在肝脏祖细胞增殖中的作用及其与肝癌关系的研究摘要目的：在正常的肝脏，肝脏祖细胞(hepaticprogenitorcells，HPCs)／卵圆细胞(hepaticovalcells，HOC)处于休眠状态，然而当肝细胞的增殖受到损伤时(如慢性的肝脏疾病)，HPCs／HOC被活化，代替肝细胞介导病理性的肝再生过程，越来越多的研究已经证明HPCs／HOC在HCC的形成中发挥重要的

2、作用，在许多啮齿类的HCC动物模型中已经证实了在HCC的形成前优先出现HOC的增殖，各种各样的化学致癌物诱导的实验性动物肝脏形成肿瘤，其癌变的过程主要为致癌物抑制了正常肝细胞的增殖和修复功能，而卵圆细胞活化、增殖，代替肝细胞的功能修复严重受损的肝脏组织。并且慢性肝脏疾病中出现HPCs的增殖增加了HCC形成的风险。HPCs被发现参与一系列肝脏损伤性疾病，并且在肝纤维化和肝脏肿瘤发生中发挥重要作用。富半胱氨酸蛋白61(Cysteinerich61，Cyr61／CCNl)是CCN蛋白家族成员之一，是分泌型的、细胞外基质蛋白，参与调节细胞的多种生物学进程，如分化、转移

3、、增殖、血管形成、细胞粘附、存活和凋亡。在干细胞中，Cyr61是主要信号通路的介导者。但是，Cyr61和肝脏祖细胞的具体关系仍不清楚。同样Cyr61被发现在多种类型的肿瘤组织中过表达并且在肿瘤形成的过程中Cyr61发挥多种不同的功能。但是目前，Cyr61在HCC中的作用仍存在争议，并且两者的确切关系及其机理尚不清楚。本研究首先分析了HCC组织、癌周肝硬化组织和正常成人肝脏组织中Cyr61的表达和HPCs活化的关系。然后对Cyr61在2-AAF／PHx大鼠肝损伤模型中对HOC活化增殖的作用及其机制进行初步研究。最后，观察并分析了Cyr61调控肝干细胞增殖的作用和

4、机制以及Cyr61对HepG2细胞在NOD／SCID小鼠体内成瘤的作用。本研究不仅为深入研究Cyr61在HPCs／HOC应答以及肝脏肿瘤形成中发挥的生物学效能及机制奠定了基础，并且对寻找肝癌早期诊断的标志物和治疗的靶点具有重要的临床意义。方法：1．病人标本中Cyr61的表达和HPCs活化增殖的关系的研究1．1采用HE、免疫组织化学SP染色法检N5例正常成人肝脏组织，30例癌周肝硬化组织，35例HCC组织中HPCs活化增殖的情况。10第三军医大学博士学位论文1．2免疫组织化学SP染色法检测Cyr61在5例正常成人肝脏组织，30例癌周肝硬化组织，35例HCC组织中

5、的表达情况，并进行半定量分析Cyr61表达的差异，分析人肝脏组织中Cyr61表达和HPCs增殖的关系。1．3免疫组织化学SP染色法、免疫荧光双标激光共聚焦检测的方法观察病人标本中Cyr61在活化的HPCs中的表达情况。2．Cyr61在2-AAF／PHx大鼠肝损伤模型中对HOC活化增殖的作用及其机制的初步研究。2．1检测分析2-AAF／PHx大鼠肝损伤模型肝脏组织中Cyr61的表达和HOC活化增殖的关系。2．1．1HE、免疫组织化学SP染色法，检i贝UHOC在2．AAF／PHx大鼠模型肝脏组织中活化增殖的情况。2．1．2采用免疫组织化学SP染色、组织透射电镜观察

6、的方法，对2一AAF／PHx大鼠模型肝脏中活化增殖的HOC进行鉴定。2．1．3Westernblotting的方法检测Cyr61在2-AAF／PHx大鼠模型肝脏组织中HOC活化增殖过程中的表达情况以及13-eatenin信号通路的异常激活情况。2．22-AAF／PHx大鼠肝损伤模型中下调Cyr61的异常表达对p．catenin信号通路的抑制作用及HOC增殖的影响的检测及分析。2．2．1应用肝脏原位注射并孵育Cyr61抗体的方法，抑N2．AAF／PHx大鼠模型肝脏组织@Cyr61的异常表达。2．2．2Westernblotting检测2-AAF／PHx大鼠模型肝

7、脏组织中Cyr61是否被抑制。2．2．3Westernblotting检N2一AAF／PHx大鼠模型肝脏组织中下调Cyr61的表达后，B．cateIliIl以及其下游靶基因cyclinDl表达水平的变化。2．2．4组织HE染色的方法检测2．AAF／PHx大鼠模型肝脏组织中下调Cyr61的表达对HOC的激活和增殖的影响。3．Cyr61调节HOC和肝癌细胞株HepG2增殖作用的研究。3．1HOC的分离、培养、鉴定以及Cyr61调控HOC增殖作用及其机制的初步研究。3．1．1两步胶原酶消化法分离培养2．AAF／PHx大鼠模型肝脏组织中增殖的HOC；免疫荧光染色法、透

8、射电镜法，对分离的HOC进行鉴定。3．