鲍曼不动杆菌适配子筛选及初步应用

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1、第二军医大学硕士学位论文鲍曼不动杆菌适配子筛选及初步应用姓名：张亚彬申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：兰小鹏201205鲍曼不动杆葡适配子的筛选及初步应用鲍曼不动杆菌适配子的筛选及初步应用中文摘要【目的】用SELEX技术，以鲍曼不动杆菌作为复合靶物质，在体外合成长度为88个nt的随机寡核苷酸文库中，筛选出与鲍曼不动杆菌具有高亲和力高特异性的适配子，再以环氧乙烷丙烯酸珠子作为筛选介质，利用生物素．抗地高辛碱性磷酸酶显色系统检测DNA适配子与鲍曼不动杆菌的亲和力，以获得能够结合鲍曼不动杆菌的高亲和力适配子。【方法】1．在体外构建总长度88nt，中间随机序列为42m，两端为固定序列

2、的寡核苷酸文，以灭活的鲍曼不动杆菌为靶分子，经过15轮“吸附一漂洗一洗脱一扩增”的SELEX筛选，筛选出针对鲍曼不动杆菌高亲和力高特异性的适配子，用生物素一抗地高辛碱性磷酸酶显色系统利进行ssDNA富集库与鲍曼不动杆菌的结合力测定。2．在第12轮、第13轮，第14轮和第15轮分别同时进行ssDNA文库与洛菲不动杆菌和溶血不动杆菌进行反筛，运用生物素一抗地高辛碱性磷酸酶显色系统来比较经过反筛和未经过反筛获得的ssDNA富集库与鲍曼不动杆菌的结合力。3．将第9轮和第12轮、第15轮筛选得到的产物进行扩增、纯化，TA克隆、测序后并用相关软件分析其一级机构与二级结构。筛选得到的产物经扩增后在聚丙烯

3、酞胺凝胶电泳图中显示，伴随着筛选轮数的递增，PCR扩增电泳条带逐渐单一纯化。4．利用生物素．抗地高辛碱性磷酸酶显色系统进行鲍曼不动杆菌与适配子的结合力测定，选出OD值较高的3个适配子，测定其亲和力：对亲和力最高的克隆适配子，做进一步的特异性与灵敏度分析。我们还运用DFA(dotfiltrationassay，DFA)对B20适配子与同菌属其他不动杆菌进行反筛选做特异性检测。【结果】1．随着筛选轮数的增加，鲍曼不动杆菌与ssDNA富集库结合的OD值不断的增加，鲍曼不动杆菌适配子的筛选及初步应用2．在第12轮反筛选得到的富集库与鲍曼不动杆菌结合后显色的OD值(0．469)是第一轮OD值(0．0

4、23)的20．39倍。从13轮、14轮、15轮的OD值可以看出，当ssDNA富集库与鲍曼不动杆菌的结合位点逐渐趋于饱和后，吸附到鲍曼不动杆菌上的ssDNA就不再增加。2．在第11轮筛选时，出现了O．D值降低，这可能是由于筛选压(选择／进化压)的影响，从而使我们所期望得到的寡核昔酸片段出现非特异性的增强。3．比较经过反筛与未经过未反筛的ssDNA富集库与鲍曼不动杆菌结合的OD值，发现有明显的差异，最低的第15轮的反筛和未反筛的ODLL值为1．7倍，到最高的第12轮比值的40倍。4．克隆测序结果表明，第9轮、第12轮和第15轮未反筛的序列均未出现富集，而对第15轮反筛的克隆子进行测序，则发现在

5、23个预期的随机序列中，有3条序列富集，相似度极高(B20、B35和B44)，同源性分析高达92％。我们利用DNASTAR软件对序列的一级结构同源性做比较，可将分成9个家族(Family)，再利用DNASISV2．5软件分别进行计算。其中有个别序列与任何一个家族均无关系。5．克隆适配子B20、B35和B44与鲍曼不动杆菌结合的OD值明显增高；进行亲和力测定，可知：B20的Kd为17．89riM，B35为86．83riM，B44为103．99riM；通过适配子B20灵敏度的结合测定，可知细菌数最低可至2．5x106。【结论】●本研究运用SELEX技术，并利用该菌属其他不动杆菌进行反筛，经15

6、轮筛选，得到针对鲍曼不动杆菌的ssDNA适配子，通过运用生物素．抗地高辛碱性磷酸酶显色系统和DFA技术对已筛选得到的适配子进行特异性、灵敏度和亲和力的分析，己成功筛选到亲和力高、特异性强的鲍曼不动杆菌适配子。【关键词】SELEX(指数富集配基的系统进化技术)；鲍曼不动杆菌；适配子；反筛；生物素．抗地高辛碱性磷酸酶显色系统；斑点渗滤法2鲍曼不动杆菌适配子的筛选及初步应用英文摘要SelectionandapplicationofaptamerstoAcinetobacterBaumannii[Objective]AbstractWehaveappliedSELEX(SystematicEvol

7、utionofLigandsbyExponentialenrichment)againstthewholeAcinetobacterBaumannii(A．Baumannii)asacomplextargettoselectsingle·strandedaptamersfroma88ntsinglestrandedDNA(ssDNA)randomlibrary．Withepoxyethaneacrylicbeadsass