水通道蛋白4基因缺失对不同类型脑损伤的影响

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1、浙江大学博士学位论文水通道蛋白4基因缺失对不同类型脑损伤的影响姓名：史文珍申请学位级别：博士专业：药理学指导教师：魏尔清20120525浙江人学博上学位论文中文摘要水通道蛋白4基因缺失对不同类型脑损伤的影响浙江大学医学院药理学博士研究生史文珍导师魏尔清教授摘要研究背景：‘水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一组介导水分子跨膜转运的细胞膜蛋白，AQP4被认为是脑内最重要的AQP亚型，主要表达在包绕脑微血管及蛛网膜的星形胶质细胞足突膜上，而在非足突的胞体表面表达较少，与其调节水平衡的功能一致。已经发现，脑外伤、脑缺血、脑肿瘤等多种脑损伤病理中，伴随脑内AQP4表达上调；对AQP4基因敲

2、除动物的研究结果提示，AQP4对血管性脑水肿和细胞性脑水肿的形成均有影响。但是，除了调节水平衡外，AQP4还影响星形胶质细胞的生长及其他功能，参与非水肿性疾病(如炎症、兴奋性氨基酸毒性等)的病理过程。脑损伤是高度复杂的病理过程，可诱发一系列细胞及分子事件。在脑损伤的急性期(数小时到数天)，由于代谢紊乱和兴奋性毒性导致神经元损伤；在亚急性期(数天到数周)，主要病变为炎症反应和细胞死亡；在慢性期(数周以后)，主要为组织修复等变化．脑损伤中，小胶质细胞和星形胶质细胞起重要作用。小胶质细胞是脑内重要的炎症细胞，小胶质细胞激活后对于脑损伤后炎症反应以及慢性神经功能恢复有重要的影响。脑损伤周边区的星形胶

3、质细胞反应性增生，最终导致胶质疤痕的形成，胶质疤痕一方面可以限制病变扩散，但又阻碍神经生长．¨浙江大学博上学位论文中文摘要脑损伤后继发的炎症是影响病变程度和恢复的主要因素之一，受许多炎症因子、炎症介质的调节。半胱氨酰白三烯(cysteinylleukotrienes，Cys【瓜)是一类重要的炎症介质，在脑缺血、脑外伤等中枢神经系统损伤性疾病发病中起重要作用。CysL，Ts主要通过半胱氨酰白三烯受体(cysteinylleukotrienereceptor，Cysu’受体)起作用，该类受体主要包括CysLTl和cysLT2受体两种亚型。药理学表明，CysLTl受体参与脑缺血后急性期神经元损伤和

4、慢性期胶质增生过程，可诱导血脑屏障通透性增加而参与缺血后炎症，并能介导粘附因子等的表达；CysLT2受体介导整体和离体水平缺血性损伤后小胶质细胞的激活和吞噬。在AQP4基因敲除小鼠，对脑缺血等损失后脑水肿变化有较多研究，但是，对于不同类型脑损伤以及炎症有什么改变，尚无系统研究，尤其需要阐明脑损伤后炎症变化特点。由于AQP4基因敲除可影响星形胶质细胞功能，由此造成一些非水肿性变化，本研究主要关注这些方面的变化。研究目的：本文采用AQP4基因敲除(AQP4乒)小鼠，观察不同类型脑损伤模型中AQP4起的作用，拟做以下4个方面的研究：1．阐明局灶性脑缺血后脑内炎症变化特点，观察缺血损伤后24h和72

5、h炎症细胞和炎症相关的半胱氨酰白三烯受体，以及其他损伤变化。2．阐明局灶性脑缺血慢性损伤过程及慢性期改变，观察缺血损伤后35天内的生存率变化，神经症状以及神经元密度和星形胶质细胞反应性增生的变化。3．阐明脑冰冻伤后损伤特点，观察损伤后24h，7天和14天损伤面积和神经元密度等变化，以及小胶质细胞反应和星形胶质细胞的胶质疤痕形成特点。4．阐明兴奋性氨基酸毒性的变化特点，建立NMDA皮层注射模型，观察损伤后24h的损伤面积和神经元密度以及血脑屏障通透性的的变化。IlI浙江大学博lj学位论文中文摘要研究方法：以线栓法制备左侧大脑中动脉阻塞(MCAO)，诱导小鼠局灶性脑缺血模型；以改良的颅骨外冰冻法

6、技术建立不同时间点的冰冻伤模型；以大脑皮层微注射技术，建立NMDA诱导脑兴奋性毒性损伤模型。以冰冻切片甲苯胺蓝染色法检测脑损伤面积；以冰冻切片IgG免疫组织化学检测法观察血脑屏障通透性的变化；以冰冻切片免疫荧光组织化学法，观察存活神经元、小胶质细胞、中性粒细胞和星形胶质细胞的的变化；以Fluoro—JadeB染色法观察坏死神经元变化；以免疫印迹法观察局灶性脑缺血损伤急性期半胱氨酰白三烯受体的表达特点；免疫荧光共染色法观察半胱氨酰白三烯受体在脑内的细胞分布。研究结果：1．AQP4缺失加重脑缺血急性损伤及炎症反应与野生型小鼠比较，AQP4斗小鼠局灶性缺血损伤后24h和72h，周边区的神经元密度缺

7、失程度增加；缺血后24h和72h中心区中性粒细胞浸润加重；周边区阿米巴样小胶质细胞活化和增殖增多，但杆状小胶质细胞的密度减少；同时，在72h周边区星形胶质细胞反应性增生和聚集减弱。AQP4乒小鼠缺血侧脑组织在缺血后24h和72h，炎症介质受体一半胱氨酰白三烯受体(CysLTl和cysLT2受体)蛋白表达增加；在两种小鼠大脑中，CysLTl和cysLT2受体蛋白细胞定位模式一致，在损伤中心区都表达于损伤的神经元