dkk1阻断wnt信号机制，爪蟾发育调控基因表达筛选及分节相关基因的研究

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1、山东大学博士学位论文DKK1阻断WNT信号机制，爪蟾发育调控基因表达筛选及分节相关基因的研究姓名：李艳申请学位级别：博士专业：发育生物学指导教师：张红卫2001.11.5友中仁:山东大学博士研究生学位论文有交宙;，，护第一早.，Dkk1阻断Wnt信号传递机制—LRP6功能区研究，//摘要沁氨基因家族包括一大类分泌性蛋白，在动物胚胎早期发育中起着极为重的作用。Wnt信号的传递过程是极为复杂的并受到许多胞内分子的调控。同时，Wnt蛋白的活性还受到许多细胞外分泌性因子的调控，包括分泌性Frizzled相关蛋白(FRPs),Cerberus

2、,Wnt抑制因子1(WIF-1)，现己证明这些分子均可直接结合Wnt蛋白，抑制与其受体Fz的结合，从而抑制信号的激活。Dickkopf(Dkk)是一类分泌性Wnt抑制分子，在爪蟾胚胎头部发育中起重要作用。Dkkl可抑制Xwnt8诱导爪蟾次级胚轴形成的活性，但不能抑制其胞内下游信号分子Dsh、B-catenin的活性。这说明Dkkl可能在Wnt蛋白或其受体Frizzled水平起作用。但Dkkl不能与Wnt或Frizzled结合，也不影响Wnt与Fz的结合，它很可能通过一个新的途径抑制Wnt信号。最近，三个小组分别在果蝇，小鼠及爪蟾中发

3、现人低密度脂蛋白受体相关蛋白6(humanLDL-receptor-relatedprotein6,hLRP6)可能作为Wnt蛋白的辅助受体参与了Wnt信号的传递，该发现使Dkkl作用机制的研究取得突破性的进展。Niehrs实验室已经证实Dkkl可直接与LRP6结合并阻断其参与激活Wnt信号的活勺为丁进一步搞清Dkk1的作用机制，本tfH}VT了以下工作:1应用PCR的方法构建了一系列LRP6缺失结构，并通过酶切图谱，细胞表面免疫染色及westernblot鉴定，筛选出结构正确并可正确表达的克隆。2.在293T体外培养细胞体系中，应

4、用细胞表面结合技术检测了各种LRP6的缺失结构与Dkk1的结合能力。山东大学博士研究生学位论文3.应用荧光酶报告基因分析检测了各种缺失结构与wnt/fz协同作用激活Wnt信号的能力。/it里}Tn·f,E3-4含Dkkl结合所必需的位点，而E1-2是与Wnt协同作用激活该信号途径所必须的，说明LRP6上的Dkk1结合位点与该受体和Wnt协同作用的位点是分开的，分别位于第3,4个EGF单元中及第1,2个EGF单元中。2,LRP64E1-4(缺失了全部的EGF单元的结构)具有组成激活的特点，表明LRP6中的EGF重复单元正常的生理功能可

5、能是抑制LRP6的激活，维持其基础的活性状态。3,旦迎旦的膜内片段在Wnt信号传导中发挥着非常重要的功能，因为缺失了膜外全部片段的结构LRP6oN，依然可以微弱地激活Wnt信号，但LRP吞IC(缺失了膜内片段的LRP6结构)完全阻断了Wnt信号，这与Tamai等的发现一致，即LRP6oC是LRP6的显性抑制结构。4,El-2是LRP6AC发挥显性抑制作用所必需的，进一步证实E1-2是LRP6与作用所需的功能区域。本工作MA果表明Dkk1并不竞争LRP6与Wnt-Fz的作用位点，而可能是通过结合LRP6改变其构象从而干扰了LRP6与W

6、nt-Fz的结合。Dkkl的作用机制与迄今为止发现的其他的Wnt抑制因子截然不同，是间接的。1-t1'34关键词:Wnt信号途留Dickkopfl;LDL-receptor-relatedprotein6:表面结萦/，产叼、州洲荧光酶报告基因分析Y缺失结nl山东大学博士研究生学位论文THE!NH!B!TIONOFDICKKOPF1!N.WNTPATHWAY一一DOMA!NANALYS!SOFLRP6AbstractWntglycoproteinsareimplicatedindiverseprocessesduringembryon

7、icpaterninginmetazoaandtheysignalthroughFrizzledtypeseven-transmembranereceptorstostabilizep-catenin.WntsignalingisantagonizedbytheextracellularWntinhibitorDickkopfl(Dkk1),memberofamultigenefamilyDkklwasinitiallyidentifiedasaheadinducerinXenopusembryosbutthemechanismby

8、whichitblocksWntsignallingisunknown.itwassuggestedthatDkklcouldnotinteractdirectlywitheitherWntorFzproteinsandraisedt