三种核酸扩增技术检测酸乳中醋化醋杆菌的研究

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1、中图分类号：Q93UDC：579密级：公开学校代码：10094讶粤￡解为丈学硕士学位论文(学历硕士)三种核酸扩增技术检测酸乳中醋化醋杆菌的研究StudyonthreenucleicacidamplificationtechnologyforSensitivedetectionofAcetobacteracetiinyoghurt作者姓名：付晓华指导教师：王红正高级工程师学科专业：微生物学研究方向：应用微生物论文开题日期：2012年12月11日㈣洲㈣㈣删嶝Y2563826学位论文原创性声明本人所提交的学位论文《三种核酸扩增技术检测酸乳中醋化醋杆菌的研究》，是在导师的指导下，独立

2、进行研究工作所取得的原创性成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中标明。本声明的法律后果由本人承担。敝作者(签名)．付晚年2口f忤5月乃日指导教师确认(签名)：谚秒乃竹年5月2弓日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解河北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在——年解密后适用本授权

3、书)论文作者(签名)：伺18：哗幽f呤年f月坫日指导教师(签名)：≥纪如炒年r月坞日摘要醋酸菌(Aceticacidbacteria)，是一类能产生乙酸的细菌，在发酵过程中将多种糖和乙醇氧化为有机酸，此特性广泛用于食醋生产、红茶茵发酵、可可豆发酵等食品工业中。然而醋酸菌可导致水果、啤酒、葡萄酒、软饮料等食品和饮料的变质。有报道表明醋酸菌可污染酸乳，代谢酸乳中的营养成分，并导致酸涩、胀包、浑浊和黏性增加等现象。国内外均未将醋酸菌检验项目列入酸乳检测的标准。醋酸菌的检测分为表型分析法和基因型分析法。表型分析法先将醋酸菌在不同固体培养基中进行选择性分离，并根据生理生化特性进行鉴定。

4、但该方法培养时间长，分离鉴定步骤繁琐，且只能检测特定培养基中的活菌数，不能真正代表实际培养条件下的数量。以分子学方法为基础的基因型分析法是目前常用的检测方法，克服了表型分析法的不足，特异性强，灵敏度高，可检测出在实际条件下醋酸菌的数量。本研究选用醋化醋杆菌为代表菌株，对酸乳中的醋酸菌污染进行初探。使用环介导等温扩增技术(U蝴P)、普通PCR及RT-PCR三种基因型分析技术进行检测，并比较了三种技术的灵敏度，+包括以下几点内容：1．根据Genbank公布的醋酸醋杆菌Acetobacteraceti(NBI地14818，GI：39573569)16S．23SrRNA转录间隔区(I

5、TS)核酸序列，选择特定区域，进行LAMP引物设计(https：／／primerexplorer．jp／1amp4．0．0／index．html)，最终选定一组引物；并将外引物F3、B3作为普通PCR和SⅥ讯GreenSYBRGreenRT-PCR的引物，特异性检测结果表明引物的特异性强，可用于醋化醋杆菌的检测。引物序列如下：F3：5'-CGGTTGGTGCGT．ATGl’GG-3’：B3：5’-CCATGCACAGAAACCATCCA．3’：FIP：5'-ACGCTTCCGCCAAAATCCCTTGGGTTGGTCTGACCCATGA·3’：BIP：5'-AATGTGACG

6、CGC兀厂6圆一黝GCCCAAGGCAGAACCCCGATA·3’：2．分析并比较3种醋酸菌DNA提取方法：热裂解法、试剂盒法、CTAB提取法，表明试剂盒法提取DNA的效果较稳定，选取该方法提取DNA。III3．对LAMP反应条件进行优化，确定25此反应体系：6mMMgCl2，1．4mmol／LdNTPs，内引物(FIT和BIT)各0．g“mol／L，外引物(F3和B3)各0．2lunol／L，1XBstDNA聚合酶反应缓冲液，8UBst酶，0．8mmol／L甜菜碱(betaine)，2旺DNA模板，用灭菌蒸馏水补足体系。62℃反应30min后，80℃3min终止反应。并改进

7、L√6山伊反应结果的检测方法，LAMP反应结束后，体系中加入10000X0．1此SYBRGreenI改进可视性效果，提高了肉眼观察的灵敏度并缩短了检测时间。4．用添加SYBRGreen荧光染料的RT-PCR技术成功进行醋化醋杆菌的定量检测，DNA拷贝数对数值与ct值的线性关系如下：y：．3．3914x+41．919，相关系数为0．9984．5．比较LAMP、普通PCR和RT-PCR技术检测醋化醋杆菌的灵敏度，分别为3．63X10～CFU／mL、3．63X101CFU／mL、3．63X101CFU／mL，