微囊藻毒素-lr诱导人支气管上皮细胞凋亡及其机制研究

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1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterStudyonApoptosisandtherelatedMechanismInducedbyMicrocystins-LRintheHumanBronchialEpithelialCellsBy：MingfengYangSupervisor：Prof．HuiZhenZhangDepartmentofOccupationalandEnvironmentalHealthCollegeofPublicHealthApril，2014原创性

2、声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均以在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者签名：柄阑耷日期：加伴年‘月，日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全

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4、径给人类及动物健康造成威胁。有文献报道蓝藻毒素可能会由于水体泡沫以及娱乐过程中产生的浪花等通过肺部呼吸进入到人体，从而可能会引起呼吸系统疾病。目的本实验通过建立稳定的微囊藻毒素-LR(Microcystins-LRMC—LR)染毒人支气管上皮(HumanBronchialEpithelial，16HBE)细胞研究模型，观察MC—LR对16HBE细胞的毒性凋亡作用及凋亡相关蛋白、线粒体途径相关分子表达的影响，旨在阐明MC．LR诱导16HBE细胞的凋亡作用及其可能机制。方法1．人支气管上皮细胞活性的测定采用MTT法检测MC．LR对16HBE细胞活性的

5、影响，并找出半数有效浓度(ECso)，为后续实验选择毒素浓度提供依据。2．活性氧测定采用2，7．二氯荧光乙酰乙酸盐(DCFH．DA)法测定16HBE细胞中RoS含量。3．线粒体膜电位测定JC．1染色法结合流式细胞仪测定荧光强度。4．细胞凋亡率的测定膜联蛋白V二异硫氰酸荧光素／碘化丙啶(AnnexinV-FITC／PI)双染色结合流式细胞术检测。5．Caspase抑*lJ齐U(z-Val-Ala-Asp(O-methyl)一fluoromethylketone，z·VAD-FMK)以及Z．VAD．FMK和MC．LR联合暴露分别对16HBE细胞活性影

6、响的测定MTT方法检测活性并找出在后续试验中Z．VAD．FMK的浓度。6．Westernblot检测Caspase．3，Caspase．9，Cyt．c，Bcl．2及Bax蛋白表达量。摘要结果1．MC．LR(0，1，10，20，30及4099／m1)处理16HBE细胞24h后，结果显示随着MC．LR浓度的升高，16HBE细胞的活性逐渐降低。且1，10，20，30及4099／ml染毒组细胞活性与对照组相比，差异均有统计学意义俨<0．05)。2．当暴露时间一定时，随着MC．LR浓度的升高，16舳E细胞内ROS的含量呈上升趋势。当MC．LR浓度分别为5，

7、10pg／ml时，ROS含量随着暴露时间的增加而增加，差异有统计学意义(P<0．05)。3．当MC．LR浓度为1099／mI时，不管作用于细胞24h或48h时，与对照组相比，线粒体膜电位均呈下降趋势；且差异均有统计学意义(P<0．05)。4．MC．LR(2．5，5，1099／m1)处理16HBE细胞24h后，细胞凋亡率分别为6．03％、17．90％、26。10％。当暴露48h后，细胞凋亡率分别为19．40％、23．80％、32．23％。5．Caspase抑制剂单独作用时，与对照组相比，当Z．VAD．FMK浓度大于100pM时，细胞活性均降低，且差

8、异有统计学意义(P<0．05)。当抑制剂与毒素联合作用时，当MC．LR浓度分别为5，1099／mI，加入的Z．VAD．FMK浓度为109