核仁素介导的转录后调节在血管新生中的作用

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1、万方数据中图分类号UDCR6610硕士学位论文学校代码型密级坌翌核仁素介导的转录后调节在血管新生中的作用PosttranscriptionalregulationofAngiogenesismediatedbynucleolin作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：王文梅病理学与病理生理学心血管病理生理基础医学院王慷慨教授答辩委员会主席中南大学2014年5月万方数据学位论文原创性声明本人郑重声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的

2、地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。,f4E者签-．g,：套鸯逵日期：韶怂年量月左日学位论文版权使用授权书本学位论文作者和指导教师完全了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版；本人允许本学位论文被查阅和借阅；学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库

3、进行检索，可以采用复印、缩印或其它手段保存和汇编本学位论文。保密论文待解密后适应本声明。作者签名：生垒鹭日期：理丝年』一月二五日导师签名．．建乏兰竺日期：丛』月堑日万方数据本课题受以下基金资助：1．国家自然科学基金面上项目(81270201)：细胞内核仁素对VEGF介导的血管生成的影响及机制研究。基金主持人——王慷慨教授。2．湖南省自然科学基金重点项目(11JJ2047)：核仁素在缺血预适应保护中的作用及其机制研究。基金主持人——王慷慨教授。II万方数据摘要核仁素介导的转录后调节在血管新生中的作用前言：核仁素是一种重要

4、的RNA结合蛋白，参与核糖体RNA的转录、转运和核糖体亚基组装的调节。近期大量研究表明核仁素通过蛋白质．RNA结合方式参与多个基因mRNA稳定性的调节，这些靶mRNA分子包括：Bcl一2、P53、GADD45、IL．2等。我室以往的实验表明核仁素参与ⅦGF介导的人脐静脉内皮细胞管型形成；而且核仁素心肌特异性表达可促进小鼠缺血区心肌血管新生。上述结果提示，核仁素在血管新生调节中发挥重要作用，而且核仁素亦可能在心肌细胞中调节血管新生相关因子的表达，促进其分泌，进而调节血管新生过程。然而其具体机制是否与核仁素介导某些血管新生

5、相关基因mRNA的转录后调节有关，目前尚不清楚。方法：本研究首先采用生物信息学分析了多个人类血管新生相关基因的mRNA序列以筛选核仁素可能结合的mRNA靶分子。随后以培养的大鼠心肌细胞H9C2和人脐静脉内皮细胞HUVEC为模型，采用蛋白质．RNA免疫共沉淀结合定量PCR技术分别证实上述潜在靶分子与核仁素的相互作用，并进一步通过基因转染方式上调或下调核仁素蛋白表达策略，采用定量PCR技术分析核仁素对上述靶基因mRNA表达以及mRNA稳定性的影响。最后建立以核仁素心肌特异性表达的小鼠心肌缺血模型，采用RNA．IP．PCR组

6、合技术验证上述靶mRNA分子与核仁素的相互作用。通过本研究以期在转录后水平阐明核仁素对血管新生过程中的可能调控机制，为血管新生调控研究提供新的思路和视野。结果：1．通过生物信息学分析，发现MMP9、VEGF、hETSl、万方数据VE—Cadherin、KDR、Tie．2、MMP2等多个血管新生相关基因mRNA的3'-UTR或5'-UTR或编码区含有数量不等的核仁素结合元件“(T／G)CCCG(A／G)”序列。2．采用蛋白质．RNA免疫共沉淀技术结和Real．timePCR分析核仁素过表达的H9C2细胞发现，上述潜在的核

7、仁素结合靶分子中仅有MMP9和VEGF与核仁素蛋白具有相互作用。然而，在HUVEC细胞中发现，Ⅶ-cadherin、Endoglin、hETSl、Angiopoietin与核仁素蛋白具有相互作用。同时发现核仁素过表达时，两种细胞中具有相互作用的靶基因mRNA表达升高，相反，核仁素低表达时，其表达则降低。3．进一步采用放线菌素D阻断心肌细胞H9C2基因转录后，观察已合成mRNA的降解速率发现，核仁素过表达可以提高MMP9基因mRNA的稳定性，抑制其降解，而核仁素低表达则抑制MMP9基因mRNA的稳定性，加速其降解。4．为

8、进一步证明上述相互作用，本研究采用蛋白质．RNA免疫沉淀分析核仁素特异性转基因小鼠缺血心肌组织发现核仁素与MMP9的mRNA存在相互结合。结论：1．核仁素的促血管新生作用机制可能与核仁素与相关基因VEGF、MMP9、VE-cadherin、Endoglin、ETS1、和Angiopoietin的mRNA结合，通过影响其mRNA的稳