牛克隆胚发育相关基因启动子区dna甲基化模式比较研究

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1、华中农业大学硕士学位论文牛克隆胚发育相关基因启动子区DNA甲基化模式比较研究姓名：申艳丽申请学位级别：硕士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：陈世林；杨利国201206牛克隆胚发育相关基因启动子DNA甲基化模式比较研究摘要胚胎发育是精卵结合表观重编程的过程，DNA甲基化是表观重编程修饰的一种主要形式，参与细胞的多种生理活动。DNA甲基化可使参与胚胎发育的基因有序表达，维持胚胎的正常发育。牛是单胎动物，为提高牛的繁殖力，更多地采用体外培养的方式获得牛早期胚胎，然后进行移植。但由于各种原因，体外胚易发生早期死亡，其成活率远低于体内胚，对畜牧业生产造成

2、一定的损失。目前已证实异常的DNA甲基化导致胚胎发育失败，因此本文从早期胚胎死亡角度出发，采用亚硫酸氢盐测序法，研究与牛早期胚胎发育相关基因OCT4、Nanog启动子区的甲基化，以揭示与胚胎发育相关基因的甲基化模式，推测克隆胚发育失败的原因，进而预测早期胚胎死亡的可能信号，提高体外胚的成活率，指导实验室生产。研究结果如下：1．本试验以牛的孤雌胚胎为材料，探讨获得高浓度胚胎基因组DNA的方法。结果表明：首先使用蛋白酶K除去透明带，然后用本试验方法可以获得浓度相对高的基因组DNA。2．检测了OCT4基因在不同时期死亡胚胎的甲基化模式。结果表明OCT

3、4基因在2一细胞、4一细胞、8．16细胞和桑葚胚阶段死亡的克隆胚的甲基化水平分别为90．50％、90．00％、92．30％、77．70％，在体外受精胚的2．细胞、4．细胞、8．16细胞、桑葚胚阶段死亡的甲基化水平分别为87．80％、81．10％、88．50％、70．60％。表明OCT4基因启动子在早期死亡胚的甲基化水平较高，且在克隆胚的甲基化水平高于体外受精胚的甲基化水平，但克隆胚和体外受精胚各阶段甲基化差异不显著(P>0．05)；同时克隆胚和体外受精胚OCT4的甲基化水平从8．16细胞到桑葚胚呈下降趋势。3．检测了Nanog基因在不同时期死亡

4、胚胎的甲基化模式。研究表明Nanog在克隆胚的2．细胞、4．细胞、8．16细胞和桑葚胚阶段死亡的甲基化水平分别为46．15％、42．31％、48．46％、53．85％，在体外受精胚的2．细胞、4．细胞、8．16细胞、桑葚胚阶段死亡的甲基化水平分别为63．85％、56．92％、69．23％、53．07％。表明Nanog基因启动子在早期死亡的体外受精胚的甲基化水平较克隆胚的高；在早期死亡的克隆胚中，Nanog甲基化水平从8．16细胞到桑葚胚时上升，而在体外受精胚则下降。同时Nanog启动子在体外受精胚的甲基化水平高于克隆胚。华中农业大学2012届硕

5、士学位论文4．总的来说，早期死亡胚中，OCT4基因启动子的甲基化高于Nanog的，推测可能由于OCT4异常的甲基化使Nanog发生异常甲基化，二者异常的甲基化可能导致早期胚胎的死亡。5．对甲基化水平存在差异的阶段进行定量分析。结果表明：不论何种方式获得的早期死亡的胚胎，其OCT4的表达量高于Nanog，且只在桑葚胚时期检测到少量Nanog的表达。推测可能由于OCT4的过度表达限制了Nanog的表达。6．结合以上推测2．细胞阶段可能是早期胚胎死亡的信号，因此可考虑体外培养时加入一定浓度的抑制剂以提高体外成活率。关键-N：孤雌胚；体外受精胚；克隆胚

6、；OCT4；Nanog；定量分析IIABSTRACTTheprocessofembryonicdevelopmentistheprocessofreprogrammingofspe姗。eggcombination·DNAmethylation．oneofthemajorepigeneticreprogrammingmodifications，participatesinavarietyofphysiologicalactivitivesofcells．DNAmethylationallowstheorderlyexpressionofgenes

7、involvedinembryonicdevelopment．maintainingthenormaldevelopmentofembryos．Cattlearesingletonanimals，inordertoincreasethebreedofcattle，SOweobtainmoreembryosbyinvitrDculture、vavandtransplantation，butduetovariousreasons，thesurvivalrateofembryo／nvitrDislo、verthan切vivo，causingtheea

8、rlydeathofembryosandcertainlossforthelivestockproduction．Now,wehaveconfirme