番茄中mir397靶基因lelac'mir397的克隆与表达分析

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1、山东农业大学硕士学位论文番茄中miR397靶基因LeLAC<'miR397>的克隆与表达分析姓名：庞明利申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：郝玉金;钟圆20080610符号及缩略词说明关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业

2、大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：—j越脚L绊导师签名_盘鱼兰；：日期：勘8盈缉虚目f霆臼山东农业大学硕士学位论文摘要LAC(EC1．10．3．2)／漆酶是一类含铜的糖蛋白(多酚氧化酶)，存在于植物、真菌、昆虫和细菌等多种有机体中，在木质素合成、离子吸收和逆境响应等方面具有重要功能，并在转录后水平受多种microRNA的调控。本研究在GenBank进行BLAST分析，获得了15个番茄以C基因相关的EST片段，并对这些EST

3、进行了同源比较和序列拼接，得到一个含有小分子RNAmiR397识别位点的以C基因片段。然后，根据该片段的核苷酸序列信息进行5’．和3'-RACE扩增，得到了番茄以C基因的全长cDNA(LeLAC=椰卯，登录号EU503151)。氨基酸序列分析表明，LeLACm郧97蛋白与南芥AtLAC7和豌豆PsLAC同源性最高。蛋白质结构域推测表明，LeLAC伽R3吵7蛋白存在一个Cu．氧化酶结构域。三P以∥‘脚7基因的时空表达分析表明，该基因在根、花、成熟果实和愈伤组织中特异性表达，而在叶和茎中不表达。鉴于小分子RNAmiR397在不同植物中是高度保守的，为了

4、检测miR397对三洲，沁97基因的转录后调控，以拟南芥基因组DNA为模板，克隆了miR397a基因的前体序列，并构建了miR397a的表达载体，用农杆菌侵染法转化番茄子叶，获得了转基因番茄植株。表达分析表明，三“么矿棚97基因在非转基因番茄的成熟果实和根中表达，但在转基因番茄的果实和根中检测不到三吐彳∥棚97基因表达，所以，三比4P娜97基因可能受miR397a的转录后调控，发生基因沉默。三洲P椰97基因编码多酚氧化酶，转基因番茄中多酚氧化酶活性分析表明，转基因植株的多酚氧化酶活性低于非转基因植株。盐胁迫下转基因番茄酶活性分析表明，转基因植株中三

5、种抗性相关酶(超氧化物歧化酶SOD、多酚氧化酶PPO和过氧化物酶POD)的活性均低予非转基因植株，表明miR397对三洲∥脚刃基因的转录后调控是植物抗逆性形成的负调控因素。关键词：番茄，漆酶，miR397a，转录后调控，抗逆性番茄中miR397靶基因L吐彳∥棚”的克隆与表达分析MolecularcloningandexpressionanalysisofmiR397targetgeneLeLACm脚97intomatoAbstractLACs(EC1．10．3．2)／Laceasesareglycoproteins、析也polyphenoloxid

6、aseacitivitydependingoncopper．Theyubiquitouslyexistinplants，fungi，insects，bacteriaandotherorganisms、^，ithcrucialrolesinligninsynthesis，ionabsorptionandstressresponses．IthasbeendocumentedthatseveralLACgeneswereregulatedbymicroRNAsinpost-transcriptionallevel．Inthisstudy，homology

7、BLASTWaSconductedinGenBankforLACESTs．Resultly,15tomatoESTshighlysimilarwitll／．∥ICgeneswereobtained，andsplicedintoaLACfragmentcontainingarecognitionsiteofmiR397．Then．itsfulllengthcDNAwasclonedwithRT-PCRand5'-andY-RACEs．itwasnamedas三比4cI，l嬲7becameofitsmiR397recognitionsite，andre

8、gisteredasEU503151inOenBank．SequencealignmentshowedthatLeLACm