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华中农业大学博士学位论文核盘菌菌核形成相关蛋白Ss--S12功能研究姓名：余洋申请学位级别：博士专业：植物病理学指导教师：姜道宏201206 核盘菌菌核形成相关蛋白Ss-S12功能研究摘要核盘菌[Sclerotiniasclerotiorum皿ib．)deBary]是一种世界性分布的植物病原真菌，能够侵染许多重要的农作物，引起多种作物如油菜、向日葵和大豆等的菌核病，给农业生产造成严重的损失。菌核是核盘菌越冬、越夏和繁殖的结构，也是菌核病的重要初侵染来源，抑制菌核的形成将切断菌核病的病害循环，因此研究核盘菌菌核形成的分子机理将为菌核病的防治提供新的思路和线索。缺乏简便稳定的转化体系是核盘菌基因功能研究的重大障碍。本研究建立了以核盘菌菌丝为受体的农杆菌介导的遗传转化体系，即直接将含有载体pTFSS的农杆菌与新鲜的核盘菌菌丝块在乙酰丁香酮存在的条件下进行共培养，2d后将菌丝块丢弃并将共培养物置于含30pg／ml潮霉索的PDA培养基中进行选择性培养，3d后获得转化子。该方法操作简便，且转化效率较稳定，平均每个培养皿能获得1-3个转化子，为深入研究核盘菌菌核形成相关基因的功能建立了良好的平台。本研究还发现潮霉素磷酸转移酶基因在核盘菌转化子的无性阶段能稳定遗传，但在有性后代发生丢失。为深入探索核盘菌菌核形成分子机理，本实验室前期利用Illumina．Solexa技术建立了核盘菌菌丝生长和菌核形成阶段的基因表达谱。分析该表达谱发现，Ss—S12(SSlG05917，XM001592945)的表达量在菌核形成阶段升高了400倍，推测其可能与核盘菌菌核形成密切相关。本研究表明Ss．S12蛋白全长352aa，具有一个信号肽结构和两个PAN模块，其同源蛋白仅仅出现在部分子囊菌中且均为功能未知蛋白。在核盘菌菌丝生长阶段，少量Ss．S12蛋白分布于细胞壁和隔膜上；在菌核形成阶段，Ss-S12表达量迅速升高，Ss．S12蛋白大量分布于细胞外加厚的细胞壁上。Ss-S12的表达水平受c舢旧水平的抑制，而与环境pH无关。Ss-S12基因沉默转化子维持细胞完整性的能力下降，但是菌丝生长和致病力与野生型菌株没有差异。在菌核形成初期，Ss-S12沉默转化子可以形成白色绒毛状菌丝团，但是菌丝团不能固化和黑化并发育成熟的菌核，在菌丝团内部菌丝排列疏松且细胞壁加厚不明显，表明Ss．S12在核盘菌菌核形成过程中起着重要作用。对Ss．S12互作蛋白进行鉴定和功能研究将有助于理解其控制菌核形成和维持细胞完整性的作用机理。本研究表明3一磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH，SSlG一07798)和沃鲁宁体主要组成蛋白(Hexl，SSlG一03527)可以与Ss-S12发生较强的直接相互作用，而转录延伸因子(EF．1a)则与Ss．S12存在着较弱的直接相互作用。GAPDH基 华中农业大学2012届博士研究生学位论文因沉默转化子只能形成白色绒毛状菌丝团，而不能形成黑色的菌核，与Ss-S12沉默转化子菌核形成表型相似；Hexl基因沉默转化子保持细胞完整性能力下降，与$s-S12沉默转化子菌丝表型相似，表明Ss．S12可能通过与GAPDH和Hexl的互作来控制核盘菌菌核的形成和维持细胞的完整性。本研究深入解析了核盘菌Ss．S12蛋白的作用及其机理，为揭示菌核形成的分子机制提供了理论依据，也为菌核病的防治提供了重要线索：此外，本研究也为探索其它真菌中Ss．S12同源蛋白的功能提供了重要参考。关键词：核盘菌；菌核；菌核形成；农杆菌介导转化；Ss．S12,PAN模块2 核盘菌菌核形成相关蛋白Ss-S12功能研究ABSTRACTSclerotiniasclerotiorum(Lib．)deBaryisanotoriousfungalpathogenwithworldwidedistribution．Thisfungusmayinfectmanyimportantcrops，suchasoilseedrape，sunflower,soybean,andcauseSclerotiniadiseases．Sclerotiaarenotonlytheimportanttissueforbreedingandoversummerandwinterto＆sclerotiorum，butalsotheimportantsotR'ceofprimarilyinfectionforSclerotiniadiseases．Represstheformationofsclerotiamayinterruptthediseasecycleinducedby＆sclerotiorumandresearchonthemolecularmechanisminvolvedsclerotialdevelopmentmayprovidesomecluestocontroltheSclerotiniadiseases．Lackofefficientandeasytransformationsystemisagreatobstacleforstudyingthegenefunctionin＆sclerotiorum．Inthisstudy，anAgrobacterium—medatedtransformationsystemwasestablishedfor&sclerotiorumbyusingthehyphaeasreceptor．A．tumefacienscellscontainingpTFSSandfreshSsclerotiorummycelialplugswereCO—cultured、析macetovanillonefor2days．ThenthemycelialplugswereremovedandtheA．tumefacienscellsandSsclerotiorumhyphaweretransferredintoPDAmediumcontaining30I．tg／mlofhygromycinB．Thetransformantsemergedontheselectiveplatesafter3days．Thismethodwassimpleandhadastableefficiencyoftransform．Onaverage，1-3transformantscanbeobtainedineachplate．ThissystemprovidedaneffectiveplatformforgenefunctionalstudyofinvolvedinSsclerotiorum．ThisresearchalsoshowedthattheHPHgeneintransformantsinheritedsteadilyintheasexualstageofs．SC昆rotiorum．butitlostinthesexualprogenies．Tostudythemolecularmechanisminvolvedinsclerotialdevelopment,ageneexpressionpatternduringthestageofhyphalgrowthandsclerotialdevelopmentWascontrastedwithIllumina-Solexainourlaboratory．Accordingtothegeneexpressionpattern，agenenamedSs-S12(SSIG_05917，XM_001592945)hadhigherexpressionlevelduringsclerotialdevelopment,withtherelativeexpressionduringsclerotialdevelopment400·foldgreaterthanthatatthehyprlalgrowthstage．Thus，Ss-S12issupposedlytohaveacloserelation、析msclerotialdevelopment．OurresultsshowedthatSs-S12proteinhas352aaresiduesandcontainsasignalpeptideandtwoPANmodules．Itshomologiesappearedonlyinthesomeascomycotinafungiandallofthoseareofunknownfunction．Atthestageofvegetativehyphalgrowth，onlyafewgoldparticlescouldbeobserveddispersed3 华中农业大学2012届博士研究生学位论文inthecellwailsandseptaofhyphae．Duringthestageofsclerotialdevelopment，thetranscriptlevelofSs-S12risedrapidlyandalargenumberofSs—S12proteinweresecretedandlocatedinthethickeneellwallofsclerotia．TheexpressionlevelofSs-S12iSdown—regulatedbycAMPlevelbuthasnorelationwitllthemediumpH．TheabilitytomaintainthecellularintegrityofRNAi-mediatedSs-S12silencedstrainswasreduced，butthehyphalgrowthandvirulenceofSs-S12silencedstrainswerenotsignificantlydifferentfromthewildtypestrain．Ss-S12silencedstrainscouldforminterwovenhyphaimassesattheinitialstageofsclerofialdevelopment,buttheinterwovenhyphaecouldnotconsolidateandmelanizedtobecomematuresclerotia．Hyphaeintheseinterwovenbodieswerethin-wailed，arrangedloosely．TheseevidenceshowedthatSs—S12playanimportantroleinsclerotialdevelopmentof＆sclerotiorum．IdentificationandfunctionalstudyonproteinswhichinteractedwithSs．S12mayprovidecluestounderstanditsmechanisminvolvedincontrollingsclerotialdevelopmentandcellintegrity．Ourresuitsshowedthatglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase(GAPDH)，Woroninbodymajorprotein(Hexl)andelongationfactor1alpha(EF·la)couldinteractwiththeSs-S12directly,andEF-lawasfoundtohaveonlyaweakinteractionwithSs-S12．GAPDH-knockdownstrainsdidnotproducetypicalsclerotia．butonlyforminginterwovenhyphalmasses．111ephenotypeWassimilartothatofSs-S12silencedtransformants．Hexl-knockdownstrainsshowedsimilarimpairmentinmaintenanceofhyphaiintegrityasSs-S12silencedstrains．TheseevidencesindicatedthattheSs—S12mayplaytheroleinsclerotialdevelopmentandthemantainenceofcellintegritythroughitsinteractionwitllGAPDHandHexl．TheresearchprofoundlyanalysedthefunctionandmechanismofSs-S12proteinin＆sclerotiorum，whichnotonlyprovidesthetheorybasisforrevealingthemolecularmechanismofsclerotiaidevelopment,butalsooffersimportantcluestocontrolSclerotniadisease．Besides，thisresearchalsoprovidesimportantreferencesforstudyingthefunctionofthehomologiesofSs-S12insomeotherfungi．Keywords：Sclerotiniasclerotiorum；sclerotium；sclerotiaidevelopment；ATMT；Ss．S12；PANmodule4 核盘菌菌核形成相关蛋白Ss-S12功能研究略缩词表5 华中农业大学2012届博士研究生学位论文6 核盘菌菌核形成相关蛋白Ss-S12功能研究1核盘菌研究进展第一章文献综述1．1核盘菌分类地位及其危害核盘菌[Sclerotiniasclerotiorum(Lib．)deBary]属真菌门，子囊菌亚门，盘菌纲，柔膜菌目，核盘茵属。核盘菌寄主范围十分广泛，能侵染75科278属的450种植物，其中大部分为草本植物(Boland&Hall，1994)。在我国，核盘菌已记载的寄主植物达36科，214种(杨新美，1959)。核盘菌能侵染许多重要的农作物，包括许多双子叶类作物，如油菜、向日葵、大豆、花生、豌豆、扁豆、莴苣等，及少量单子叶作物，如洋葱和郁金香等(Boland&Hall，1994)。由核盘菌引起的病害多达60种，如棉腐病(Cottonyrot)、水霉病(Waterysoftrot)、茎腐病(Stemrot)、颈腐病(Crownrot)、花期枯萎病(Blossomblight)、白霉病(Whitemould)和菌核病(Sclerotiniadiseases)等(Purdy,1979)。在美国，核盘菌造成的经济损失每年超过2亿美元(Boltoneta1．，2006)。在我国，油菜、向日葵、大豆和保护地蔬菜上发生的菌核病十分普遍和严重，问题非常突出，严重时导致减产80％以上，每年造成巨大的经济损失。核盘菌不仅在作物的生育期造成严重危害，而且在储藏和运输过程中侵染，给作物的产量和品质造成了巨大的损失(杨新美，1959；王道本，1986)。1．2核盘菌生活史与病害循环核盘菌一般以菌核(Sclerotium)在土壤、病残体和混杂于种子中越冬和越夏。菌核由菌丝纠结形成，其质地致密且表皮黑化，这种结构有助于其抵抗外界的各种不良环境。在外界环境不适宜其萌发的条件下，菌核能在土壤中存活长达8年(Adams&Ayers，1979)。核盘菌不能形成分生孢子，其一般以子囊孢子进行初侵染。子囊孢子由子囊盘产生并释放，孢子释放至空气中随气流传播。子囊孢子一般不能直接侵染健康的植株叶片或者茎秆，而是先在衰老的花瓣或者脱落的叶片等组织上营腐生生活并萌发形成菌丝，进而以菌丝侵染健康的组织(Inglis&Boland，1990；Turkington&Morrall，1993)。除萌发形成子囊盘外，菌核也能以菌丝的形式进行萌发，菌丝直接侵入至 华中农业大学2012届博士研究生学位论文衰老的叶片或者根部并引发症状，如莴苣菌核病、胡萝卜菌核病、向日葵萎焉病等(Patterson&Grogan，1985；Holley&Nelson,1986；Bardin&Huang，2001)。菌丝可以形成黑色的侵染垫以穿透表皮，也可以直接从气孔或伤口侵入到内部组织，并杀死整个细胞和组织，引起组织腐烂(Lumsden&Dow,1973；Guimar五es&Stotz，2004)。在发病后期，菌丝可以在腐烂的组织表面或内部形成黑色的菌核。1．3核盘菌致病机理核盘菌为死体营养性的非专性寄生菌，其菌丝侵入到寄主组织后直接杀死寄主细胞。一般认为核盘菌分泌的草酸(Oxalicacid，OA)和细胞壁降解酶类(Cell—wall-degradingenzymes，CWDEs)在其菌丝侵染和定殖过程中起主要作用。草酸是核盘茵致病力的基本决定因子(Dutton&Evans，1996；Zhou&Boland，1999)。草酸形成缺陷型突变体不仅减弱了对寄主植物的致病力，而且也不能产生菌核(Godoyeta1．．1990)。草酸的分泌可能从以下几个方面增强了核盘菌的致病力：(1)草酸使寄主细胞的pH值降至4．5(Marcianoeta1．，1983；Magroeta1．，1984)，低pH值有利于增强病原菌细胞壁降解酶的活性。(2)草酸螯合寄主细胞壁中的Ca2+离子，弱化了寄主的防卫能力(Bateman&Beer,1965)。(3)草酸和Ca2+结合形成草酸钙晶体，堵塞寄主的导管和维管束，从而导致寄主发生萎蔫。(4)草酸作为一种非专化性的毒素，可以直接对寄主细胞产生毒化作用。(5)草酸能干扰寄主气孔防卫细胞的功能并抑制脱落酸对气孔的控制，使气孔处于非正常开放状态，使得菌丝更加容易侵入(Guimar萏es&Stotz，2004)。(6)草酸可以诱发细胞程序性死亡(Programmedcelldeath，PCD)，引起细胞凋亡，促进了病害的扩展(Kimeta1．，2008)。(7)在侵染初期，草酸可以抑制寄主的活性氧爆发和胼胝质沉积，从而抑制寄主的防卫反应等(Williamsetal．，2011)。除草酸外，核盘菌在侵染植物过程中能分泌大量的细胞壁降解酶来降解细胞壁以软化寄主的表皮，从而促进菌丝侵入到寄主体内(Hancock,1966；Lumsden．1969；Rioueta1．，1991)。目前已发现核盘菌在侵染过程中能产生多种细胞壁降解酶，其中研究较为深入的为果胶酶，特别是多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturo-nases，PGs)，其在水解果胶的过程中起着重要的作用。果胶被水解后，植物的细胞壁发生软化，有利于病原菌的侵入和定殖，同时果胶水解后的产物也为病原菌提供丰富的碳源(Rioueta1．，1991)。在许多病原真菌中，多聚半乳糖醛酸酶编码相关基因已被克隆并被证实为致病相关因子(Shieheta1．，1997；tenHaveeta1．，1998；Garcia-Maceiraeta1．，2001；Karsetal．，2005)。在核盘菌中也克隆了多种多聚半乳糖醛酸酶基因，包括 核盘菌菌核形成相关蛋白Ss-S12功能研究内切多聚半乳糖醛酸酶(EndoPGs)基因，如PG2、PG3、ssp93、p95、ssp95、p96、p97、PGa、pgl、p92、p93、sspgld、ssp96和PGb等，以及少量外切多聚半乳糖醛酸酶(ExoPGs)基因，如ssxpgl和ssxp92(Boltoneta1．，2006)。研究发现，核盘菌中的多聚半乳糖醛酸酶同工酶家族由2个亚家族共7个基因编码，其编码的产物经糖基化和蛋白质水解等途径产生了多种异构体(Fraissinet-TachetetaL，1996)。在灰霉菌(Botrytiscinema)中，5种EndoPGs表现出不同的生化特性，而且对不同的寄主致腐能力也不一样(Karsetal．，2005)。在核盘菌侵染的过程中，不同的EndoPG基因的表达水平和表达时间均不同(Kaszaeta1．，2004；Lieta1．，2004；Oliveiraeta1．，2010)，推测核盘茵PGs基因的多样性可能与其适应不同的寄主有关。除果胶酶之外，其它的一些细胞壁降解酶也在核盘菌致病过程中发挥着重要作用。Yajima等(2009)研究发现敲除核盘菌中的B．木糖酶前体基[羽Ssaxp后，菌株对油菜叶片和茎秆的致病力显著下降，表明p木糖酶前体是核盘菌重要的致病相关因子。1．4菌核病防治由于核盘菌寄主范围广，菌核生命力强且产生大量的子囊孢子，因此对菌核病的防治一直是农业生产上的一个难题。目前对作物菌核病的防治主要依靠化学农药防治(Steadman，1979；Bardin&Huang，2001；Muellereta1．，2002)。尽管使用化学农药面临抗药性的问题(Gosseneta／．，2001)，迄今为止喷施化学农药仍是田问防治作物菌核病最有效最直接的方法(Baileyeta1．，2000；Budge&Whipps，2001；DelRio甜a1．，2004)。生物防治方法是控制作物菌核病的另一种策略，其具有可持续、对环境友好等特点，是近年来研究的热点之一。研究表明多种微生物对核盘菌具有寄生或拮抗作用，其中以盾壳霉(Coniothyriumminitans)和细顶棍孢霉(Sporidesmiumsclerotivorum)研究的最为深入并进行了初步的商业应用(Whipps&Gerlagh，1992；DeVrijeeta1．，2001；delRioeta1．，2002；Lieta1．，2006；Partridgeeta1．，2006)。但是由于生防制剂具有较大的局限性，如难保存、见效慢，且防治效果易受环境条件的影响，在实际生产上应用的仍然较少。除寄生菌外，利用感染病毒的弱毒菌株来控制作物病害也是生物防治的重要实践方向(Nuss，2005；Ghabrial&Suzuki，2009)。在欧洲，通过在林间释放感染了CHVl病毒的栗疫菌(Cryphonectriaparasitica)弱毒菌株，有效的控制了栗疫病的危害(Heiniger&Rigling，1994)。到目前为止，在核盘菌中已发现了多种弱毒相关病毒，如SsDRV(Xieeta1．，2006)、SsHADV-1(Yueta1．．2010)和SsHVI／SZ．150(Xieeta1．，2011)，这些病毒均导致核盘菌致病力减弱，9 华中农业大学2012届博士研究生学位论文具有潜在的生防能力。菌核病难以控制的一个重要原因是生产上还没有培育出对该病免疫或高抗的品种。尽管已经在几种重要农作物如大豆、向日葵和油菜中克隆到多个抗病相关的数量性状位点(quantitativetraitloci，QTL)，这些QTL有的与寄主避病相关，有的则与寄主的生理抗病性有关(Kim&Dier,2000；Arahanaeta1．，2001；Kolkman&Kelly,2003；Miklaseta1．，2003；Zhao&Meng，2003；Berteta1．，2004)，但是转抗病基因育种尚处在探索阶段。由于草酸是核盘菌的主要致病因子，一个重要的抗病策略就是通过转基因技术使寄主获得特异性降解草酸的能力。其中研究较多的是草酸氧化酶，它能将草酸氧化分解形成H202和C02(Laneeta1．，1993)。H202不仅会对微生物的细胞产生直接的毒害作用(Peng&Ktic，1992)，还会诱发寄主产生获得性抗病性(Gaffneyetal．，1993；Le6netal．，1995)。目前，己通过农杆菌介导转化的方法成功将小麦草酸氧化酶分别转入到大豆、向日葵和油菜中，结果表明转基因株系对菌核病的抗性明显增强(Donaldsoneta1．，2001；Hueta1．，2003；Dongeta1．，2008)。除草酸氧化酶外，草酸脱羧酶也能分解草酸。Cunha等(2010)将桑金钱菌(Flammulinasp．)草酸脱羧酶转入到大豆中，发现其有助于提高大豆对核盘菌的抗性。除与降解草酸相关的酶外，细胞壁降解酶与抗菌核病相关。Liu等(2011)将爪哇拟青霉(Paecilomycesjavanicus)几丁质酶基因PjChi-1通过农杆菌介导转入到油菜中，结果发现转基因株系增强了对菌核病的抗性。此外，一些与植物抗病信号途径相关的基因也被用于菌核病的抗病育种中。Wang等(2009)在油菜中超量表达丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)基因，结果显示转基因株系对菌核病提高了抗性。2核盘菌菌核形成及其机理2．1菌核的结构一些真菌发育到一定的阶段，菌丝不断生长，相互纠结在一起形成了一种颜色较深的坚硬菌丝体组织——-菌核。目前为止，已发现许多丝状真菌均可以形成菌核，这些真菌大致可归属于子囊茵亚门如链核盘菌属(Monilinia)、核盘菌属(Sclerotinia)、麦角菌属(Claviceps)、葡萄孢属(Botrytis)、轮枝菌属(Verticillium)、曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)，以及担子菌亚门如丝核菌属(Rhizoctonia)、小核菌属(Sclerotium)、核线菌属(Typhula)和鬼伞属(Coprinus)等(Willetts&Bullock,1992)(图1．1)。lO 图1．1部分丝状真菌形成菌核形态A：大丽轮枝菌；B：水稻丝核菌；C：蜂蜜曲霉；D：肉孢核瑚菌。E：核盘菌；F：麦角菌；G：齐整小核菌；H：葱鳞葡萄孢菌：图片来自互联网。Fig．1．1SderotiamorphologyofsomefilamentousfungusA：Verticilliumdahlia；B：R庇拓Dc幻n胁Solani；C：Aspergillusmelleus；D：Typhulaincarnate；ESclerotiniasclerotiorum；F：Clavicepspurpurea；G：Sclerotiumrolfsii；H：BotryotiniasquamosaPicturesarecitedfrominternet．11 华中农业大学2012届博士研究生学位论文一般认为核盘菌属真菌形成的菌核由三个部分组成：外表皮、皮层和髓部，而其它属真菌形成的菌核可能仅仅由皮层和髓部组成。外表皮约为3层细胞厚，由增厚的着色拟薄壁细胞组成。外表皮细胞的着色是由于细胞壁中黑色素沉积导致的。黑色素的沉积降低了菌核的通透性，既很好的保持了菌核内的水分和营养物质，也使得外界的辐射及化学等有毒物质不能进入菌核内(Young&Ashford，1992)。此外，由于黑色素的沉积，细胞壁中酚醛聚合物增多，增强了菌核对一些由寄生真菌的分泌的多糖酶的抵抗作用(Willetts，1971)。皮层位于外表皮和髓部之间，其一般为2．4个细胞厚。在核盘菌属真菌中，皮层最厚的部位可达6个细胞厚(Kohn&Grenville，1989a；Kohn&Grenville，1989b)。尽管在不同的种间菌核皮层的厚度可能不一样，但是一般认为皮层的发育与菌核形成时氧的浓度和可利用的养分相关(Willetts&Bullock，1992)。髓部位于菌核的最里面，并占据着菌核中最大的体积。通过透射电镜观察发现，髓部的细胞均有着加厚的细胞壁，它们由原始的细胞壁和环绕着细胞壁的较厚的纤维层组成。加厚的细胞壁富含几丁质、p一1．3-葡聚糖和蛋白质，其中纤维层由p．1．3。葡聚糖和蛋白质组成。据推测，这种异化的结构可能在维持菌核形态，保持菌核的水分和能量等方面均起着重要的作用(Willetts&Bullock，1992)。2．2菌核形成过程基于不同时期核盘菌菌核的形态特征，一般将菌核的发育过程分成3个阶段。首先是起始阶段，即菌丝与菌丝相互纠结在一起，形成小的绒毛状的菌丝团。然后是发展阶段，在这一阶段，菌丝团不断增大。最后是成熟阶段，菌丝团表面黑化并固化，内部硬化，同时伴随着液滴渗漏出来(Townsend&Willetts，1954)。这种划分方法简单明了，但是稍显笼统，为了更加方便的研究菌核的形成机制，“等(2009)将菌核的形成过程划分为6个阶段(图1．2)：(S1)起始阶段：菌丝相互纠结，形成小的气生菌丝簇；(S2)凝结阶段：菌丝团不断增大和浓缩，在其表面出现小的分泌液滴；(S3)增大阶段：菌丝团体积达到最大，表面分泌大量的液滴，这一时期的菌丝团的表面仍然为白色；(S4)固化阶段：菌丝团表面开始变成浅黄色并形成外表皮；(S5)着色阶段：由于黑色素沉积，菌核表皮呈黑色；(S6)成熟阶段：菌核体积达到最大，表皮黑化并硬化。12 核盘菌菌核形成相关蛋白ss_s12功能研究图1．2核盘菌茵核形成的不同阶段(Li&Rollins，2009)Fig．1．2SclerotiumdevelopmentstagesofS．sclerotiorum(Li&Rollins，2009)2．3菌核形成相关因子2．3．1环境相关因子菌核的形成受多种环境因子的共同影响，其中主要包括光照、草酸、pH、活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)等。光照可能会影响核盘菌由菌丝生长向菌核发育的转变，继而影响菌核的发育。菌核可能在黑暗条件下形成起始原基，但是光照条件对于菌核原基的进一步发育及菌核的成熟却是必须的(Miller&Liberta，1977)。在许多微生物中，光照通过调节生物钟来控制生物的生长发育。到目前为止，在核盘菌中光照影响菌核形成的机理还不清楚。一般认为中性或碱性的环境会抑制菌核的形成，而酸性的环境则有利于菌核的形成(Rollins&Dickman，2001oRai等(1971)研究发现菌核形成的最适pH为4．4．5。在核盘菌生长后期，菌丝分泌的草酸会使得环境pH下降，从而有助于菌核的形成，草酸产生缺陷型突变体则不能形成菌核(Godoyeta1．，1990)。Rollins(2003)将核盘菌中调控pH信号转导途径相关基因的转录因子编码基因pacl敲除后，突变体不能形成成熟的菌核，进一步表明核盘菌菌核形成可能受体内pH信号转导途径的调控。低浓度的ROS在细胞信号转导途径中起着重要的调控作用。在许多微生物中，过氧化状态(hyperoxidantstates)是细胞分化的首要推动力(Fangeta1．，2002；Lara．Ortizeta1．，2003)。在核盘菌中，Chet等(1975)首次提出菌核的形成需要02的参与。Georgiou等(1997)发现过氧化脂(1ipidperoxides)在菌核形成起始前开始增加，在菌核形成起始阶段达到最大。在培养基中加入羟自由基清除剂(hydroxylradicalscavenger)时，核盘菌和丝核菌(Rhizoctoniasolani)的菌核形成均受抑制(Georgioueta1．，2000)。这些证据表明细胞内由02引起的氧化应激(oxidativestress)是核盘菌由菌丝生长转向菌核发育的重要诱导因素(Georgioueta1．，2006)。与细胞 华中农业大学2012届博士研究生学位论文内氧化还原反应相关的硫醇类物质也在菌核形成过程中也起着重要的作用。研究发现增加细胞内谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(CSH)的含量会抑制核盘菌由菌丝向菌核的转变，该抑制作用可能与GSH和CSH中．SH基团的抗氧化作用相关(Patsoukis&Georgiou．2008)。此外，营养条件也与菌核形成密切相关，不同的营养源如碳源、氮源、矿物质、维生素等均能影响菌核的形成(Rai&Agnihotri，1971)。2．3．2细胞内信号转导途径环境因素对生物生长发育的调控是通过调节细胞内信号转导途径起作用的，其中一个重要途径是G蛋白偶联受体介导的cAM]a信号通路途径。越来越多的研究表明c舢皿及其调节的信号通路在核盘菌菌核形成过程中起着重要的作用。Rollins等(1998)首次报道提高内源性和外源性的cAIMP浓度均会抑制核盘菌菌核的形成。当敲除腺苷酸环化酶基因sacl后，核盘菌cA_]V[P的浓度显著降低，菌丝生长和菌核形成均表现异常(Jurick&Rollins，2007)，表明菌核形成与cAMP之间有着十分紧密的联系。cAM]a通过激发蛋白激酶A(proteinkinaseA，PKA)的活性使得某些酶或者重要的蛋白被磷酸化，进而调节多种生理生化反应并控制生物的生长发育过程。Harel等(2005)研究发现在菌核形成起始阶段PKA活性出现升高，而在菌核形成缺陷型菌株中PKA活性始终处于较低的水平；相应地，当加入PKA活性诱导剂时，PKA活性显著升高，而菌株则形成更多的小的绒毛状菌丝团，这些证据表明核盘菌的菌核形成与PKA活性有关。但是当敲除PKA蛋白复合体中的一个催化亚基后(pkal)，核盘菌仍然能形成菌核，且细胞内PKA催化活性与野生型没有差异(Juricketa1．，2004)，推测可能是由于核盘菌中的PKA蛋白复合体存在另外一个催化亚基(pka2)，该亚基可以独立的为菌核发育提供足够的催化活性。除了cAMP-PKA信号途径之外，环境因子还可以通过MAPK信号通路来调控细胞内的各种生化反应。MAPK可对外界信号刺激作出反应，并磷酸化下游蛋白。Chen等(2004)从核盘菌中克隆到一个MAPK蛋白编码基因smkl，smkl在菌核形成起始阶段的表达量达到最高，其表达受到酸性pH值的诱导和外源cAMP的抑制；smkl基因沉默菌株不能形成成熟的菌核，表明在核盘菌中可能存在受smkl转导的信号途径即MAPK途径，该信号途径能对环境信号作出反应并调控菌核的形成。Ras蛋白作用于MAPK信号途径上游并调控MAPK的活性，当核盘菌中的Ras蛋白活性被抑制时，MAPK的活性同样受到抑制并且菌核形成受阻，进一步表明菌核的发育受到Ras／MAPK信号途径的调控(Chen&Dickman，2005)。深入研究发现高浓度14 核盘茵菌核形成相关蛋白Ss-S12功能研究的cAMP抑制菌核形成的原因可能在于其能正向调控Rap一1蛋白活性，而Rap-1能够阻止Ras将上游信号传递至MAPK，使得MAPK信号途径中断，进而影响菌核的发育，如图1．3所示(Chen&Dickman，2005)。l觚氏PK(Sinkl)／Hyphalgrowthandscleroti曩ldevelopment图1．3cAMP／MAPK信号途径控制核盘茵菌核的形成(Chen＆Dickman，2005)Fig．1．3eAMP／MAPKsignaltransductionpathwaycontrolthesclerofialdevelopmentin&sclerotiorum(Chert&Dickman，200s)2．3．3蛋白磷酸酶与PKA、MAPK等蛋白激酶相反，蛋白质磷酸酶(proteinphosphatascs，PPs)具有去磷酸化活性，其与蛋白激酶协调作用来调节蛋白的磷酸化水平，从而调控细胞内的各种生理活动。蛋白质磷酸酶根据其作用底物可分为：酪氨酸特异性磷酸酶(PTPlB)、丝氨酸／苏氨酸特异性磷酸酶(包括PPl、PP2A、PP2B、PP2C、PP4和PPS)、双特异性磷酸酶(VHR)、组氨酸磷酸酶(PHP)和脂类磷酸酶(PTEN)。研究发现PP2A和PP2B在核盘菌菌核发育、致病等过程中均起着十分重要的作用。PP2B，又被称为钙调磷酸酶(Calcineurin)，其广泛参与到细胞内各种信号转导途径，并在调节细胞内离子平衡、形态分化和保持细胞壁完整性中均起到重要作用。Harel等(2006)研究发现当在培养基中加入PP2B的抑制剂FK506或者CyclosporinA时，核盘菌菌核发育受到抑制。PP2B编码基因canl在菌核形成成熟阶段表达量最大，该基因被沉默后菌核发育受到抑制。相应的，当在培养基中加入能合成CyclosporinA的尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)的培养液时，核盘菌菌核数量显著减少，但是菌核的平均干重却增加了(Rodriguezetal．，2006)。这些证据表明PP2B在核盘菌菌核发育过程中起着重要的调节作用。 华中农业大学2012届博士研究生学位论文PP2A。也在核盘菌菌核发育过程中发挥着重要作用。当沉默核盘菌PP2A蛋白调节亚基B基因咖J『时，菌核发育受到影响(Erantaleta1．，2007)。深入研究发现当沉默smkl时，PP2A和NADPH氧化酶(Nox)的活性均受到抑制(Erantaleta1．，2007)，表明核盘菌中MAPK、PP2A和活性氧之间存在功能上的联系。上述证据表明核盘菌菌核发育可能受到磷酸化酶和去磷酸化酶的共同作用，它们通过调节下游一些关键因子的磷酸化水平来调控细胞内重要的生理生化反应，进而控制菌核的发育。综合以上研究，Erental等(2008)建立了一个初步的核盘菌菌核发育相关的信号转导模型(图1．4)。根据这一模型，核盘菌通过细胞表面G．蛋白偶联受体对外界环境因素如pH、Ras、光照和水分等进行感应，将外界信号通过cAMP．PKA、MAPK等信号通路进行级联放大，并激活或抑制作用于这些信号通路下游的一些与菌核形成相关的重要基因的表达，从而控制菌核的形成，但迄今为止，对于这些下游的重要基因仍然知之甚少。2．3．4凝聚素类蛋白除信号转导途径相关蛋白外，其它的蛋白也可能在核盘菌菌核发育过程中起着重要作用。研究发现，一些结构蛋白在菌核发育阶段的表达量显著升高，深入研究这些蛋白的功能将为揭示菌核的发育机理提供重要线索。Petersen等(1982)和Russo等(1982)分别从小核盘菌(＆minor)、三叶草核盘菌(＆trifoliorum)和核盘菌的菌核中分离到一个菌核组织特异性蛋白(Ssp)，该蛋白占菌核可溶性蛋白的35．40％，而在菌丝中则检测不到该蛋白的存在。Russo等(1985)将Ssp蛋白从核盘菌总蛋白中分离纯化出来，发现其由3种电荷异构体组成，其中一个异构体占据了Ssp蛋白总量的80-90％。免疫电镜实验表明Ssp蛋白位于细胞液泡里面。Li等(2009，2010)将Ssp蛋白进行了氨基酸测序，发现该蛋白二级结构与海藻糖特异性凝聚素有较高的相似性。Ssp基因缺失突变体在PDA培养基上的表型与野生型没有差别，但是在添加潮霉素的抗性平板上形成的菌核数量显著减少，推测该蛋白可能与核盘菌抗逆性相关。 ～S～～～、SS卧、il。Olllllk'll|：t]signalsIpH／ROSc“门nn／～～Itj25f17PP2B【SKl(；IlI、lAPKKK、～l(jI(pJHlMAPKlERK—Like}‘pphIIX4KUtllc-gr-，pkcl，tSSI(i一∽I7pka2(％IG一⋯I：图1．4核盘菌菌核形成的信号转导模型(ErentaletaL，2008)Fig．1．4Signaltransductionmodelinvolvedinsclerotialdevelopmentin&sclerotiorum(Erentaleta1．，2008)17U．、HX(●■■■ltJ■■●SKPAIⅣ 华中农业大学2012届博士研究生学位论文3真菌遗传转化研究进展自Mishra等(1977，1979)首次成功进行粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)的DNA遗传转化以来，真菌遗传转化研究取得了很大的进展，并建立了PEG介导的遗传转化、电激介导的遗传转化、转座子介导的遗传转化、限制性内切酶介导的遗传转化、农杆菌介导的遗传转化等多种方法，这些方法极大的促进了真菌基因功能的相关研究。3．1PEG介导的真菌遗传转化聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)具有改变细胞原生质膜通透性的作用。PEG转化法是通过在培养物中加入PEG等多聚物协助基因转移，以促使原生质体融合的方法。PEG和二价阳离子(M92+、Ca2+、Mn2+)以及外源DNA在原生质体表面形成沉淀颗粒，通过原生质体的内吸作用而进入细胞体内。原生质体作为受体细胞具有群体数量大，容易获得纯合性的转化子等优点，但是该转化系统的转化效率不稳定，易受到PEG的分子量和浓度、CaCl2的浓度和pH等转化参数的影响。此外许多真菌的原生质体具有培养难度大、再生频率低和周期长等缺点，制约了该方法在真菌遗传转化中的应用。3．2限制性内切酶介导的遗传转化限制性内切酶介导的遗传转化(RestrictionEnzyme．MediatedIntegration，REMI)是在限制酶介导下通过线性化质粒DNA随机插入而将外源基因整合到受体菌染色体DNA上，从而获得基因标记菌株的新方法。自Schiestl等(1991)利用REMI技术转化啤酒酵母以来，该技术已经应用到许多真菌的遗传转化研究中，如玉米小斑病菌(Cochliobolusheterostrophus)(Lueta1．，1994)、梨黑斑病菌(彳lternariaalternate)(Aksmatsueta1．，1997)、盘基网柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)(Kuspa&Loomiseta1．，1992)、烟曲霉(Asperillusfumigatus)(Browneta1．，1998)、藤仓赤霉(Gibberellafujikuroi)(Linemannstonseta1．，1999)、菜豆炭疽菌(Colletotrichumlindemuthianum)(Redman&Rodriguez，1994)、胶孢炭疽菌(Cgloeosporioides)(Yakobyeta1．，2000)、青霉菌(Penicilliumpaxilli)(Itoh&seott，1997)、稻瘟菌(Magnaporthegrisea)(Shi&Leung，1995)和玉蜀黍球腔菌(Mycosphaerellazeae—maydis)(Yuneta1．．1998)等。与PEG介导的遗传转化相比，REMI转化效率和单拷贝插入的概率较高， 核盘菌菌核形成相关蛋白Ss-S12功能研究有利于后续的质粒拯救和基因功能分析(Bolkereta1．，1995；Manivasakameta1．，2001)。但是REMI也有一些缺点，如由于外源DNA的整合在基因组上具有整合热点，倾向于高频转录的基因位点，因此很难建立覆盖整个基因组的突变体库。由于RE／VII涉及到染色体的酶切和修复，而在染色体的修复过程中可能会引起基因的突变，因此使得许多转化子的表现变化不是由外源DNA的转化引起，从而在实际操作过程中造成基因功能的误译(Epsteinetal．，1998)。此外，REMI技术还存在多位点、串联插入及质粒的重排，这也造成质粒拯救的困难(Vithalanieta1．，1996)。3．3根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展．根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)是一种普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌，在根癌农杆菌里含有一种Ti质粒，Ti质粒上有一段可转移的DNA(T-DNA)，自然条件下，农杆菌可以通过伤口侵染植物，并将这段T-DNA转移到植物细胞并整合到植物的染色体中。根据这一原理，建立了农杆菌介导转化的方法。研究表明，通过农杆菌介导的方法不仅可以转化植物而且可以转化细菌、动物和真菌。在真菌中，1995年Bundock等首次利用农杆菌介导啤酒酵母遗传转化并获得成功。1998年deGroot等成功利用农杆菌介导转化了黑曲霉(Aspergillusniger)、粗糙脉胞菌(Neuroposporacrassa)、里氏木霉(Trichodemareesei)、伞菌(Agaricusbisporus)、胶胞刺盘孢(Colletotrochumgloeosporioides)和镰孢菌(Fusariumvenenatum)等六种丝状真菌，并证明T-DNA可以单拷贝地随机插入到丝状真菌染色体中，他们的研究不仅为开拓了真菌遗传转化的新途径，而且显示T-DNA转化在丝状真菌的插入突变、基因标记等方面具有很好的潜力。到目前为止，已经有多种真菌成功利用农杆菌介导进行了遗传转化(Michielseeta1．，2005；Utermak&Karlovsky,2008)。与REMI、PEG介导等方法相比，农杆菌介导转化有以下优点：一是转化所用受体较为简单，菌丝、孢子和子实体均可以直接作为受体进行转化，因此不需要制备原声质体，减少了影响转化效率的因素。二是转化效率较高，研究表明农杆菌介导丝状真菌的转化效率一般在300．7200个转化子／107个细胞，比其它的真菌转化方法高100．1000倍(Bundocketal．，1995)。三是获得的转化子性状稳定，尤其是当采用具有单核的分生孢子为转化受体时，可以得到后代遗传物质不分离的转化子，避免了由真菌菌丝多核所造成的转化子不稳定的难题。四是转化子大部分为单拷贝插入突变体，因此标签基因的分离相对容易。因此，越来越多的真菌正利用农杆菌介导转19 华中农业大学2012届博士研究生学位论文化进行基因功能的研究。3．4核盘菌遗传转化研究进展相比与子囊菌亚门其它真菌来说，核盘菌遗传转化方法研究起步较晚，其中一个可能的原因是核盘菌不能产生分生孢子，没有很好的转化受体。2003年，Rollins建立了PEG介导的核盘菌原生质体转化方法，该方法的建立为深入研究核盘菌菌核形成、致病等分子机理提供了一个良好的平台。到目前为止，利用该方法已经对核盘菌中多个基因进行了功能分析，如pacl(Rollins，2003)、smkl(Chen&Dickman．2004)、pphl(Erentaleta1．，2006)、cnal(Hareleta1．，2007)、sacl(Juricket讲．，2007)、cryl(Veluchamy&Rollins，2008)、Ssaxp(Yajimaeta1．，2009)、sspl(Li&Rollins，2010)等。本实验室采用农杆菌介导的方法对原生质体进行了转化，并成功获得了转化子(肖雪琼，未发表)。但是原生质体制备过程繁杂，转化效率不稳定，可重复性差。2006年，Weld等以核盘菌的子囊孢子作为受体，利用农杆菌介导的方法对其进行了遗传转化并成功获得了转化子。与PEG介导的原生质体转化方法相比，该方法转化效率较高，能达到8x10‘5个转化子／子囊孢子。该方法首次报道了通过核盘菌与农杆菌共转化来获得转化子，开辟了核盘菌遗传转化的新途径，但是此方法需要人工诱导核盘菌产生予囊孢子，费时费力，而且有些菌株在实验室条件下很难产生子囊孢子，制约了该方法的使用。2008年，Levy等借鉴植物细胞的转化方法利用高压气体基因枪对核盘菌菌丝和菌核进行了转化，并成功获得了核盘菌的转化子。基因枪法省去了制备原声质体或者子囊孢子的过程，所需时间较短，且操作较为简便，但是该方法需要用到基因枪，其价格较为昂贵，限制了该方法的大规模应用。江明(2007)建立了农杆菌介导的核盘菌茵丝碎片转化方法，并分析了利用该方法对核盘菌致病相关基因进行了功能研究的可行性，但是这种方法转化效率低，可重复性差，且操作过程复杂，容易被杂菌污染。4基因功能分析策略4．1RNAi技术在基因功能研究中的应用4．1．1RNAi的发现1995年，Guo等发现注射反义RNA(antisenseRNA)和正义RNA(senseRNA)20 核盘菌菌核形成相关蛋白Ss·S12功能研究均能特异性地阻断秀丽新小杆线虫(Caenorhabditiselegans)中的par-1基因的表达，当时还不能解释其原因。1998年，Fire等研究证实在上面的正义RNA抑制基因表达实验中，正义RNA中意外混入了一些双链RNA(dsRNA)，而正是这些双链RNA抑制了目的基因的表达，Fire将这种双链RNA对基因表达的抑制作用称至为RNA干扰(RNAinterference，删)。随后研究发现RNAi现象在许多种生物中均存在，如线虫、真菌、果蝇、植物和动物中。4．1．2RNAi作用原理RNAi的作用机制可能是细胞内双链RNA在Dicer酶的作用下，切割成21．23bp的小干扰RNA(smallinterferingRNAs，siRNAs)，siRNAs可与部分核酸酶结合并使其激活，从而精确降解与siRNAs序列匹配的mRNA，完全抑制了该基因在细胞内的转录和表达。具体来说，RNAi的作用过程分为2个阶段：首先是起始阶段，外源的dsRNA经转基因、病毒感染等方式进入细胞内后被核酸酶RNAasem家族中的Dicer酶(dsRNA．specificendonuclease)所特异性识别，然后逐步被其切割成21-23nt的核苷酸片段，每个siRNA3’端带有2个非配对碱基。siRNA的生成启动了下一个阶段⋯．效应阶段。在效应阶段，Dicer通过PAZ结构域与Argonau：te蛋白互相作用，然后核酸内外切酶、解旋酶与Argonaute蛋白结合进而与siRNA一起形成具有多个亚单元的核糖核苷酸蛋白复合物(RNA．inducingsilencingcomplex，RISC)。RISC中的解旋酶解开siRNA双链，使其反义链互补结合到靶标mRNA上与之相匹配的特异性序列上，然后RISC中的核酸内切酶降解mRNA，将其切割成为21-23nt的siRNA。最后是扩增阶段，即新生的siRNA和RISC又进入到上一个循环。新合成的dsRNA反复被降解，不断产生更多新的siRNA，使得靶标mRNA不断减少，产生基因沉默的现象。由于这种现象发生在基因转录之后，因此被称为转录后基因沉默(post-transcri-ptionalgenesilencing，PTGS)(Tus砌eta1．，1999；Brummelkampeta1．，2002)。4．1．3RNAi在真菌基因功能研究中的应用RNAi不仅揭示了细胞内基因沉默的机制，而且是后基因组时代研究基因功能的有力工具。与传统的基因敲除相比，RNAi技术不仅能够鉴定某一个基因的功能，还能对基因家族进行研究，且具有操作简便，作用迅速和特异性高的特点，因而广泛应用到动物、植物、线虫等基因功能研究上。1992年，Macino等首次在粗糙脉胞菌中发现由siRNA导致的基因沉默的现象，将其称之为基因压制(genequelling)。此21 华中农业大学2012届博士研究生学位论文后，随着研究的不断深入，RNAi技术也越来越多的应用到真菌的基因功能研究中。Liu等(2002)应用RNAi技术对新型隐球酵母(Cryptococcusneoformans)的CAP59和ADE2基因进行了研究，起到了与基因敲除相同的效果。Rappleye等(2004)应用RNAi技术证实酵母细胞壁中叶(1，3)．葡聚糖是组织胞浆菌的重要治病因子。此外RNAi技术还应用于烟曲霉(Mouynaetal．，2004)、稻瘟菌(Kadotanietal．，2003)、炭疽菌(Nakayashikieta1．，2005)、致病疫霉(Phytophthorainfestans)(Latijnhouuwers酣a1．，2004)、镰刀菌(McDonaldeta1．，2005)、盾壳霉(宫晓艳，2007)等真菌的基因功能研究中。近年来，随着核盘菌全基因组序列的公布和核盘菌遗传转化体系的建立，RNAi技术也越来越多的应用到核盘菌致病和菌核形成等相关基因的功能研究中。Harel等(2006)矛U用RN础技术对钙调磷酸酶编码基因cnal进行了沉默并成功获得了cnal表达受到抑制的菌株。Erental等(2007)应用RNAi技术对PP2A编码基因pphl进行了研究，结果表明PP2A在核盘菌菌核形成和致病过程中均起着重要的作用。江明(2007)利用RNAi技术对核盘菌受病毒感染后表达下调基因Ss．CYPl进行了功能分析，表明Ss．CYPl可能与核盘菌菌株致病性相关。4．2蛋白质亚细胞定位方法4．2．1绿色荧光蛋白定位绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)是从维多利亚多管发光水母(AequoreaHctoria)中分离得到的，其为一个含有238个氨基酸残基的蛋白质，分子量约为27KDa(Shimomuraetal．，1962)。GFP为两个规则的内含一个0【．螺旋和外面包围11个B．折叠的D．桶状结构组成的二聚体，其能够吸收蓝光，当受到紫外光激活时，能发射绿色或黄绿色荧光，最大发射峰为509nm。GFP的发光机制是其自身含有的，荧光发射不需其它外源的辅因子。研究发现GFP不仅在水母中具有活性，而且能在许多细菌、真菌、昆虫、植物和动物中表达并发出强烈的绿光，其表达不仅与种属无关，也与细胞的种类和位置无关，对细胞和组织没有副作用，因而被广泛用作分子生物学研究中的报告基因。特别是在蛋白细胞和组织定位中，利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜对标记蛋白进行细胞和组织定位研究。在丝状真菌中，GFP蛋白已经用于标记玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)(Spellingeta1．，1996)、构巢曲霉(Fernandez—Abaloset讲．，1998)、玉米小斑病菌(Cochliobolusheterostrophus)(Maor 核盘菌菌核形成相关蛋白Ss-S12功能研究eta1．，1998)、稻瘟菌(Kershaweta1．，1998)、炭疽病菌(Colletotrichumspp．)(Dumaseta1．，1999)等，极大的促进了这些真菌的分子生物学研究。在核盘菌中，Silva等(2009)利用GFP蛋白对核盘菌菌丝进行标记，并清晰的观察了菌丝在寄主组织上侵染和定殖的过程。4．2．2免疫胶体金电镜技术胶体金(Colloidalgold)是由氯金酸(HAuCl4)在白磷、抗坏血酸、柠檬酸钠等还原剂的作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用成为一种稳定的胶体状态。免疫胶体金标记技术(Immunogoldlabellingtechnique)是利用胶体金带负电荷的性质，使其与抗体相吸引，从而将抗体标记的一种新型免疫标记技术。当用胶体金标记的抗体与抗原反应时，在光镜水平胶体金液呈现鲜艳的樱红色；在电镜水平下，金颗粒具有很高的电子密度，在胶体金标记蛋白结合处可以看到黑色颗粒，因而非常有利于对抗原和抗体物质进行定位、定性乃至定量研究。1971年，Taylor等将免疫胶体金标记技术与电镜技术相结合，建立了免疫胶体金电镜技术(Immunogoidelectronmicroscopytechnique)。与其它标记技术(如荧光、放射性同位素和酶)相比，该技术有以下优点：(1)胶体金制备相对容易：(2)可以标记各种大分子物质，如多糖、多肽、凝聚素和抗体葡萄球菌蛋白等；(3)颗粒大小可以进行控制，外形均一，因而可以在一张切片上进行双重标记甚至多重标记；(4)特异性较高，胶体金对组织细胞的非特异性吸附非常少；(5)灵敏度较高，不仅可以对抗原进行定位，还可以根据金颗粒的数量对抗原进行相对半定量；(6)染色简单，不影响组织超微结构，结果更加客观真实。与GFP定位相比，免疫胶体金电镜技术对蛋白等抗原的亚细胞定位更加精确，为蛋白的功能研究提供了有力的工具。在真菌中，免疫胶体金技术已经广泛应用于蛋白亚细胞定位研究中，如酵母絮凝蛋白Flolp(Bonyeta1．，1997)、稻瘟菌沃鲁宁体主要组成蛋白Hexl(Soundararajaneta1．，2004)、新型隐球菌(CrytococcusNeofonmans)漆酶蛋白(Panepintoeta1．，2009)等。4．3互作蛋白的筛选与鉴定方法4．3．1酵母双杂交酵母双杂交系统(Yeasttwo．hybridsystem)是1989年由Fields等在研究酵母转录因子GLA4的表达调控模式的基础上时提出并首先建立的。一个完整的GLA4蛋 华中农业大学2012届博士研究生学位论文白由2个结构域组成，分别是位于N端1．174位氨基酸残基区域的DNA结合域(DNAbindingdomain，DNA-BD)和位于C端768．811位氨基酸残基区域的转录结合域(Activationdomain，AD)。这两个结构域分别起着不同的功能，BD能与GLA4效应基因(GLA4-responsivegene)的上游激活序列(Upstreamactivatingsequence，UAS)相结合，而AD则可以与转录复合体相结合，启动UAS下游的基因的转录。这两个结构域单独分开时并不能起作用，只有当它们在空间上相互靠近时GLA4才能表现出转录因子的活性，并激发下游的报告基因的表达。基于以上的原理，Fields等初步建立了酵母双杂交系统。他们将两个蛋白，即靶蛋白(Prey)和诱饵蛋白(Bait)，分别与BD和AD结合，如果这两个蛋白能够形成复合体，那么BD和AD则能够在空间上相互靠近，使GLA4表现出转录因子的活性，并激发下游报告基因的表达(图1．4)。如果这两个蛋白不能相互作用，则GLA4就不能表现出活性，报告基因也不能表达，通过报告基因的表达情况就可以知道两个蛋白之间互作与否。图1．4酵母双杂交原理(引自www．clontech．corn)Fig．1．4Theyeasttwo—hybridprinciple(citedfromwww．clontech．tom)酵母双杂交系统是生物学领域具有划时代意义的研究方法。与传统的研究蛋白质互作的方法相比，酵母双杂交实验基于酵母细胞内的有活性的蛋白质之间的互作，避免了提纯和分离蛋白引起的蛋白变性等问题，因而真实的反应了生物体内的互作情况。此外，该系统敏感度非常高，任何微弱和瞬间的互作也可以通过报告基因的表达来检测到。到目前为止，酵母双杂交系统已经被广泛应用到生物学研究的多个领域，特别是在检测已知蛋白质之间的相互作用、筛选与已知蛋白质互作的未知蛋白质、绘制蛋白质作用图谱以及鉴定药物靶标等研究中均发挥了重要作用，酵母双杂交技术已成为后基因组时代研究蛋白功能的有力工具。Jim6nez等(2006)年以马铃薯Y病毒(PPV)的CI(cylindricalinclusion)蛋白作为诱饵筛选其在烟草寄主细胞中的互作蛋白，发现CI可与光系统I中的PSI．K蛋白直接互作，PPV在PSI．K 核盘菌茵核形成相关蛋白Ss·S12功能研究基因沉默植株中的积累量显著升高，表明这种互作在PPV的侵染过程中起着重要的作用。Kwon等(2011)以RacA蛋白作为诱饵筛选构巢曲霉各个生长阶段的靶蛋白cDNA文库，发现NoxR(NADPHoxidaseregulator)与RacA能直接互作，揭示了RacA蛋白控制构巢曲霉分生孢子的形成机理。尽管酵母双杂交技术在蛋白．蛋白互作的研究上有着广泛的应用，但是它也有一些缺陷，特别是假阳性问题，即通过酵母双杂交证实的两个互作蛋白在真实情况下的互作可能并不发生。据统计，到2002年，在已通过酵母双杂交技术验证的80000多种蛋白质互作中仅有2000多种互作被另外的方法所验证(Auerbacheta1．，2003)。为了克服这些缺陷，双杂交系统在应用中不断的进行改进，并衍生出许多的新的研究方法，如酵母单杂交系统(Lietal．，1993)、反向双杂交系统(Ⅵdal甜a／．，1996)、SOS蛋白招募系统(Aronhcimeta1．，1997)、三杂交系统(Senguptaeta1．，1996)和哺乳动物双杂交系统(Dangeta1．，1991)等。4．3．2免疫共沉淀免疫共沉淀(Co．immunoprecipitation，CO．IP)是利用抗原和抗体之间专一性作用的原理来研究蛋白质相互作用的经典方法。其原理是当向细胞裂解液中加入某一抗体时，抗体便可与已知的抗原形成特异性免疫复合物，该复合物中不仅包括抗原蛋白质，还包括与抗原相互作用的其它蛋白质。将该复合物洗脱后，经Westem杂交或者蛋白质测序的方法便可鉴定出与抗原互作的未知蛋白。这种方法常用于鉴定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于筛选与特定蛋白互作的新的蛋白。Crocker等(2004)利用免疫共沉淀技术获得了核磷酸蛋白．间变性淋巴瘤激酶(Nucleophosmin-anaplasticlymphomakinase，NPM．ALK)的互作蛋白，揭示了该蛋白可能作用的信号通路。Thedieck等(2007)通过免疫共沉淀结合质谱技术获得2个新的雷帕霉素靶蛋白(Mammaliantargetofrapamycin，mTOR)结合蛋白，从而揭示了该蛋白在细胞凋亡中的作用。免疫共沉淀研究的互作蛋白为细胞内翻译后修饰的天然蛋白，蛋白的互作也是发生在天然状态下，因而可以真实的反映细胞内蛋白质之间的互作情况。此外，抗原与相互作用的蛋白以细胞中相类似的浓度存在，避免了过量表达所造成的假阳性。但是这种方法也有一定的局限性，首先是必须制备针对抗原的单克隆或者多克隆抗体，过程较为复杂；另外，通过免疫共沉淀筛选到的蛋白之间可能并不是直接相互作用的，需要通过其它的方法进行进一步的验证。 华中农业大学2012届博士研究生学位论文4．3．3双分子荧光互补绿色荧光蛋I刍(OFF)及其衍生物青色荧光蛋白(Cyanfluorescenceprotein，CFP)、黄色荧光蛋白(Yellowfluorescenceprotein，YFP)和蓝色荧光蛋白(Bluefluorescenceprotein，BFP)一般以完整的蛋白质序列作为在活体中表达和检测的标记物。近年来研究发现GFP及其衍生蛋白可从氨基酸第155或173位点切断，分割成两个不发光的荧光蛋白片段，即氨基末端片段和羧基末端片段，当这两个片段分别与能够互作的两个蛋白相连形成融合蛋白并在体内同时表达的时候，两个荧光蛋白互补片段就可在融合蛋白的相互作用驱动下重新组合形成荧光复合物，恢复发光特性，这种技术称为双分子荧光互作技术(Bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC)(Hueta1．，2002；Hu&Kerppola,2003)。基于BiFC技术的特点，将两个待检测的蛋白分别与荧光蛋白的氨基末端片段和羧基末端片段融合，通过观察荧光的产生就可以推断待检测的两个蛋白在体内是否互作，还可通过检测荧光的位置和强度判断两个蛋白在体内互作的位置和互作能力的强弱。与其他检测蛋白互作的方法相比，BiFC技术有以下优点：(1)荧光蛋白片段和待检测蛋白组成的融合物在动物、植物、微生物中均能正常表达，适用范围较广；(2)荧光蛋白复合体可通过荧光显微镜直接观察得到，较为直观。(3)荧光蛋白复合体的构成不需要加入其它的辅助因子，排除了外界环境的影响。鉴于其具有上述多个优点，BiFC技术已经广泛应用于判断两个蛋白互作与否、鉴定蛋白互作的亚细胞定位、鉴别酶一蛋白复合体、泛素及蛋白底物复合体可视化等研究中。Cheng等(2008)利用BiFC和CO．IP发现甘蔗花叶病毒北京分离物(SCMV-BJ)的HC．Pro蛋白可以与寄主的铁氧还原蛋白(Ferrdoxin，Fd)V相互作用，以干扰FdV蛋白的加工和运输，从而造成叶绿体结构与功能发生破坏。Kim等(2011)利用BiFC方法研究发现裂殖酵母(Schizosaccharomycspombe)硫醇谷氧还蛋白(monothiolglutaredoxins)Grx4与铁吸收相关基因阻遏子Fepl在细胞核内发生相互作用，揭示了酵母细胞通过Grx4蛋白调节铁吸收的机制。5本研究的目的与意义核盘菌是重要的植物病原真菌，其引起的菌核病给农业生产造成了严重的损失。目前在实际生产上还没有发现对菌核病免疫的品种，对菌核病的防治主要依赖化学农药。由于长期大面积使用单一的农药使得病原菌极易产生抗药性，本实验室初步的检测结果也表明我国部分地区抗多菌灵的核盘菌菌株出现频率正在增高，存在极 核盘菌菌核形成相关蛋白Ss-S12功能研究大的风险。化学农药的使用也带来了食品安全和环境污染等问题。基于此，大力发展新的安全防控措施势在必行。深入研究核盘菌生物学及分子生物学特性对发展新的防治技术以降低油菜等作物的生产风险具有重要意义。核盘菌生活史中有三个重要阶段，即侵染寄主、菌核形成和菌核萌发(包括以菌丝形式萌发和以子囊盘形式萌发)，终止任何一阶段，菌核病均可获得有效的控制。从分子生物学层面解析病菌的致病过程、菌核形成过程和菌核萌发过程等可以更加系统的认识核盘菌，为菌核病的安全控制寻找新的靶位点。菌核是核盘菌越冬、越夏和繁殖的结构，同时是菌核病的初侵染来源，抑制菌核形成将有效的切断菌核病的病害循环。研究菌核形成的分子机理将为菌核病的防治提供新的思路和线索。迄今为止，关于菌核形成的分子机理相关研究仍十分缺乏。本实验室前期采用Illumina-Solexa技术对核盘菌在菌丝生长阶段、菌核形成阶段的基因表达进行了比较，结果发现一些基因在菌核形成阶段表达量显著性升高，推测这些基因可能在核盘菌菌核发育过程中起着重要的作用。本研究将建立一种简便稳定的核盘菌遗传转化平台，并在此平台的基础上结合RNAi技术、免疫胶体金、免疫共沉淀及酵母双杂交等方法对菌核形成阶段特异性表达基因的功能进行深入的研究，研究结果可为深入理解核盘菌的菌核形成机制提供线索，也将为菌核病的防治寻找新的思路。27 华中农业大学2012届博士研究生学位论文本研究的技术路线上困墨，田宇 核盘菌菌核形成相关蛋白Ss．S12功能研究第二章农杆菌介导的核盘菌菌丝转化体系的建立核盘菌[Sclerotiniasclerotiorum(Lib．)deUary]是-类世界性分布的植物病原真菌，能侵染75科450种植物(Bolandetal．，1994；Boltonetal．，2006)。核盘菌引起的作物菌核病是世界粮油作物、蔬菜等农作物生产上分布最广、为害最严重的病害之目前在生产上还没有出现对菌核病免疫的品种，菌核病的防治主要依靠化学防治。而化学农药的长期大量使用带来了抗药性和环境污染等问题，具有不可持续性，因此迫切需要从分子水平对核盘菌的生长发育和致病机理进行深入的研究，为开发新型化学药剂和培育抗病品种提供理论依据。到目前为止，许多重要的植物病原真菌已采用PEG／CaCl2或者农杆菌介导的方法进行了遗传转化和功能基因研究。相比之下，由于核盘菌转化体系仍不成熟，从分子水平解析其生长发育和致病机理受到了很大的限制。Rollins(2003)利用PEG介导的方法对核盘菌的原生质体进行了转化，并获得成功，但是原生质体制备过程复杂，且转化效率不稳定。Weld等(2006)利用农杆菌介导对核盘菌的子囊孢子作了转化，效率达到8x10。5个转化子／子囊孢子，开辟了核盘菌转化的新途径。但是核盘菌的子囊孢子诱导周期较长，且部分菌株在人工条件下难以产生子囊孢子，限制了该方法的使用。本实验室用农杆菌介导对核盘菌的菌丝碎片进行了转化，并成功得到了转化子(江明，2007)，但是这种方法转化效率低，而且方法繁琐，实验过程易被杂菌污染。本研究在该方法的基础上进行了改进，建立了一种简便稳定的农杆菌介导的核盘菌菌丝转化体系。1材料与方法1．1材料1．1．1菌株及培养方法核盘菌Sunf-M菌株：强毒力，分离于向日葵，华中农业大学植病生防实验室保存，菌株于20℃用PDA培养；PDA斜面中4℃保存。大肠杆菌JMl09：用作克隆的宿主菌，37℃用LB液体振荡培养或固体静置培养，于含有20％甘油的LB液体培养基中-70℃保存。 华中农业大学2012届博士研究生学位论文农杆菌EHAl05(Str'和Rif)：Ti质粒的宿主菌，用于农杆菌介导的核盘菌遗传转化。菌株于28℃用LB液体振荡培养或固体静置培养，在含有15％甘油的LB液体培养基中．70℃保存。1．1．2质粒及载体双元载体pTFSS(Kanr)，用于农杆菌介导的核盘菌遗传转化，由本实验室构建(江明，2007)。1．1．3抗生素、酶及其它试剂卡那霉素、利福平、链霉素、头孢霉素、氨苄青霉素和尼龙膜为Ameresco公司产品：潮霉素B为Roche公司产品；分子量Marker、TaqDNA聚合酶、dNTP、杂交探针标记试剂等为TaKaRa公司产品；乙酰丁香酮(AS)、乙磺酸钠购自Sigma公司；DNA回收试剂盒为Axygen产品；(a一32P)dCTP为北京福瑞生物工程公司产品；其它各种化学试剂为国产化学分析纯。1．2方法1．2．1农杆菌介导的核盘菌菌丝转化方法本方法在江明(2007)建立的农杆菌介导核盘菌菌丝碎片转化方法的基础上进行了改进，以核盘菌菌丝代替菌核碎片，具体步骤如下：将带有双元载体pTFSS的农杆菌在含50斗g／ml卡那霉素、50gg／ml链霉素和50bg／ml利福平的LB培养基上划线，于28℃培养2d直至长出单菌落。挑取单个菌落放入2IIll的液体LB培养基中，于28℃振荡培养1d。将培养好的农杆菌按2％的比例加入到MM培养基中，然后于28℃振荡培养2d。将培养好的农杆菌于4000rpm离心15min，去上清液，用等体积的IM培养基重新悬浮沉淀。测定重新悬浮的农杆菌的OD600值，并用IM培养基将其稀释至OD600为0．3．0．4左右，加入400gg／ml的AS。将稀释好的农杆菌于28℃条件下振荡培养6h左右。取1“农杆菌均匀涂布在覆盖玻璃纸的CO-IM培养基(含400斗g／mlAS)上，然后在玻璃纸上接种新鲜的核盘菌菌丝块。20℃黑暗条件下共培养2d后将菌丝块丢弃，然后将玻璃纸揭至无菌的培养皿中，上面覆盖15IId含30bg／ml潮霉素和500btg／ml头孢霉素的PDA30 核盘茵菌核形成相关蛋白Ss-S12功能研究培养基，于20℃条件下培养3-4d。挑取平板表面长出的菌落于含30gg／ml潮霉素PDA培养基上培养，菌落能继续的生长推定为转化子。1．2．2核盘菌总基因组DNA的提取取0．2g菌丝于液氮中研磨成白色粉末，加入1“65℃预热的CTAB提取缓冲液于65℃水浴5min，中间轻轻混匀两次；加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)混匀，于12000rpm离心10min，取上清并加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)混匀，12000rpm离心10min；取上清加入等倍体积的异丙醇，室温沉淀30min后于12000rpm离心10min；沉淀用70％乙醇洗涤两次，于37℃温箱干燥；干燥后加入30山TE于37℃条件下溶解30min，于．20℃保存备用。1．2．3转化子的PCR鉴定和测序分析为通过PCR鉴定所得的转化子，根据潮霉素磷酸转移酶基因(删)的序列设计特异性引物HPH．FP(5’．CAGCGTCTCCGACCTGAT-3’)和HPH．RP(5’．TCTGCGGGCGATTTGT．3’)，扩增转化子中的刷哪基因的部分序列。反应程序如下：95℃4min(1cycle)；95℃30sec，60℃30sec，72℃1min(35cycles)；72℃5min。将PCR扩增产物经DNA回收试剂盒纯化，连接到pMDl8一T克隆载体上，并通过热击转化导入大肠杆菌JMl09中，挑取单菌落进行PCR鉴定，阳性克隆进行测序分析。1．2．4转化子无性阶段的稳定性分析随机挑选5个核盘菌转化子，置于在9cm的PDA平板的一端培养，4d后当菌丝长满培养皿时，挑取菌丝块转移至新的PDA平板的一端继续培养。连续培养3个月后，将转化子挑取到潮霉素浓度为50llg／ml的PDA平板上观察菌株生长情况。1．2．5转化子有性阶段的稳定性分析随机挑选核盘菌转化子，于胡萝卜培养基中培养1个月后收集菌核。菌核于5％次氯酸钠溶液中漂洗三次后用无菌水中洗净。将菌核半埋于湿润的河沙中，于16℃条件下培养3个月，直到萌发形成成熟的子囊盘。用负压法收集子囊孢子，并将子 华中农业大学2012届博士研究生学位论文囊孢子用无菌水稀释至106个／ml。采用两种方法研究子囊孢子潮霉素的抗性：(1)取100山稀释的子囊孢子涂布于潮霉素浓度为30I．tg／ml的PDA平板上，观察子囊孢子萌发情况。(2)将稀释的子囊孢子涂布于PDA平板上，将子囊孢子萌发形成的单菌落转至潮霉素浓度为30}tg／ml的PDA平板上培养，观察菌株生长情况。1．2．6转化子单孢分离物脚基因PCR验证为验证转化子子囊孢子单孢分离物中的潮霉素磷酸转移酶基因(删)是否缺失，设计特异性引物HPHfl．FP(5’．CCCTTATCTGGGAACl’ACT-3’)和HPHfl．RP(5’．GTGCTGCAAGGCGATTAA．3’)，扩增HPH基因包含启动子和终止子的全长部分。反应程序如下：95℃4min(1cycle)；95℃30sec，58℃30sec，72℃2．5min(35cycles)72℃5min。1．2．7转化子单孢分离物脚基因Souhthem杂交分析基因组DNA的提取采用CTAB法，具体步骤同1．2．2。酶切、电泳、转膜及固定：选取核盘菌Sunf-M，转化子及其单胞分离物的基因组DNA各15“g，选取在质粒pTFSS的删基因上不含有识别位点的限制性内切酶KpnI进行酶切，通过电泳检测酶切是否完全。完全酶切后，于4℃条件下在0．8％的琼脂糖凝胶中缓慢电泳16．18h(1V／cm)。电泳结束后，切去点样孔处的凝胶，余下的凝胶用于转膜。转膜：方法参考Sambrook等(1989)。将凝胶浸入O．25mol／LHCl10min，用蒸馏水洗涤两次后将凝胶于0．1mol／LNaOH溶液中浸泡20min，后将凝胶移至O．1mol／LTris(pH8．O)中处理20min，再用10×SSC处理15min。用一块大于凝胶面积的有机玻璃作为平台，将其放入大的托盘内，在有机玻璃平台上面平铺一张新的滤纸，倒入10xSSC并使液面略低于平台表面，将滤纸两端浸入SSC之中并使滤纸均匀湿润：在滤纸上铺一层比凝胶稍大的滤纸并使其均匀湿润，将凝胶正面向下置于滤纸上，在凝胶上方放置与凝胶同样大小的尼龙膜，小心去除滤纸与凝胶之间的气泡，尼龙膜预先于10xSSC中侵泡5min。在膜上放置两张与凝胶同样大小的滤纸，均匀湿润并去除气泡后在滤纸上放多层同样大小的吸水纸，用约500g的重物压实。转膜约20h后小心取下尼龙膜，并用10×SSC清洗以除去其上的琼脂糖碎片，室温凉干后于真空80℃下固定2h。 核盘菌菌核形成相关蛋白Ss．S12功能研究预杂交：将尼龙膜于3×SSC、O．1％SDS溶液中预湿后放入杂交管，使其正面朝向管的内部，加入适量的3×SSC、0．1％SDS溶液于65℃处理15min。弃上述溶液，加入适量预杂交液(Churchbuffer)于65℃预杂交5h。探针标记及杂交：用限制性内切酶SacI和励DI酶切质粒pTFSS，电泳并回收删片段。以回收的片段作为模板DNA，采用随机引物法制备杂交探针，方法如下：在EP管中依次加入25ngDNA和2山的随机引物，补加ddn20至总体积为14山；将EP管于95℃加热3min后迅速置于冰中冷却5min；在上述反应液中加入10×缓冲液2．5山、dNTP2．5山、Klenow1山和0【_32p标记的dCTP(50¨Ci)5“l，混匀后置于37℃反应20min。反应结束后加入10mol／LNaOH和175山ddH20使其终浓度达到O．1mol／L，室温静置处理5min使探针变性。将制备好的探针小心加入到杂交管底，于65℃杂交过夜。洗膜及压片：去除杂交液，加入2xSSC、o．1％SDS溶液于中65℃洗15min，然后用1×SSC、0．1％SDS溶液洗15min，最后用0．5×SSC、0．1％SDS溶液洗15min。用保鲜膜包膜后压磷屏(使其正面朝向增感屏面)，置于磷屏盒中在室温下压屏3h，用FUJIFILM磷屏扫描仪扫描磷屏。2结果与分析2．1农杆菌介导的核盘茵菌丝转化以核盘菌菌丝代替菌丝碎片作为转化受体，通过农杆菌介导转化将双元载体pTFSS转入到核盘菌Sunf-M中，成功获得了转化子，如图2．1箭头处所示所示，当有AS存在的时候，在加入30pg／ml潮霉素的选择性平板中长出了转化子的菌落。在3次重复试验中，平均每个选择性平板中会长出1．3个转化子，转化效率较稳定。 华中农业大学2012届博士研究生学位论文图2．1农杆菌介导的核盘菌菌丝转化过程中的选择性培养Fig．2．1SelectiveincubationduringtheA．tumefaciens—mediatedtransformationofmycelialots．SC|erotiorum2．2转化子的PCR鉴定和测序结果分析随机选取部分转化子于PDA培养基上培养2d后收集菌丝并提取其基因组DNA，以出发菌株Sunf-M为对照，用HPH-FP／RP引物进行扩增，结果表明所有转化子均能扩增出850bp大小的特异性片段，而出发菌株则扩增不出相应大小的片段(图2．2)，表明这些转化子均为阳性。随机挑取部分PCR产物进行序列测定，对获得的序列进行BLAST(blast．ncbi．nlm．nih．gov／Blast．cgi)比对分析，表明PCR扩增出的均为潮霉素磷酸转移酶基因(脚)片段，进一步证实了PCR鉴定结果的可靠性。bp12345678910图2．2核盘菌转化子的PCR鉴定泳道l：DNA分子量标准；2：Sunf-M；3．10：转化子。Fig．2．2ConfirmationofS．sclerotiorumtransformantswithPCRamplificationLane1：DNAMarker；2：Sunf-M；3．10：Transformants．∞约伯752 核盘菌菌核形成相关蛋白ss．s12功能研究2．3转化子稳定性分析2．3．1转化子无性阶段稳定性分析核盘菌转化子于PDA培养基上继代培养三个月后，仍能够在含50“g／ml潮霉素的PDA培养基上生长，表明利用本研究建立的方法所获得的转化子对潮霉素抗性非常稳定，整合的T-DNA在核盘菌无性阶段能够稳定遗传并表达外源基因，通过这种转化方法所获得的转化子能够用于进一步的生物学特性和分子生物学分析。2．3．2转化子有性阶段稳定性分析核盘菌转化子的子囊孢子于PDA平板上培养3d后，即长出大量的单菌落，但在潮霉素浓度为30“e：Jml的PDA平板上始终不能萌发(图2．3)。随机选取部分子囊孢子在PDA平板上萌发形成的单菌落至潮霉素浓度为301．tg／ml的PDA抗性平板，发现菌株始终不能生长(图2．4)。图23转化子子囊孢子潮霉素抗性分析A：含30I．tg／ml潮霉素的PDA培养基；B：PDA培养基。Fig．2．3HygromycinresistanceanalysisofascosporesoftransformantsA：PDAmediumwith30Ixg／mlHygromycin；B：PDAmedium． ——一华中农业大学2012届博士研究生学位论文图2．4转化子单孢分离物潮霉素抗性分析A、B、C分别为转化子TFSS．4、TFSS．6、TFSS．8及其单孢分离物，平板中间为转化子，周围为单孢分离物。Fig．2．4Hygromycinresistanceannlysisofsingle—ascosporeisolatesoftransformantsA，B，CaretransformantTFSS-4，TFSS一6，TFSS一8andtheirsingle．ascosporeisolatesrespective．Transformantisinthecenterofplateandsingle--ascosporeisolatesarearound．2．3．3转化子单孢分离物删基因PCR验证由于转化子单胞分离物不能在潮霉素抗性平板上生长，推测删基因在核盘菌的有性后代中可能丢失。随机挑选部分转化子及其单胞分离物并提取基因组DNA，用引物扩增删基因全长，结果显示所有转化子均能扩增出2000bp大小的片段，而单孢分离物则扩增不出相应大小的片段(图2．5)，表明脚基因在核盘菌的有性后代中丢失。bp12345678910111213141516171819202313094166557436123222027图2．5转化子单孢分离物HPH基因PCR验证泳道1：分子量标准；2：质粒pTFSS；3：Sunf-M；4：TFSS．4；5：TFSS．6；6：TFSS．8：7．11：TFSS．4单孢分离物；12．16：TFSS一6单孢分离物；17．20：TFSS．8单孢分离物。Fig．2．5ConfirmationofHPHgeneinsingle-ascosporeisolatesoftransformantsbyPCRamplificationLine1：DNAMarker；2：plasmidpTFSS；3：Sunf-M；4：TFSS．4：5：TFSS．6：6：TFSS．8：7．11single—ascosporeisolatesofTFSS一4；12—16：single—ascosporeisolatesofTFSS．6：17．20single-ascosporeisolatesofTFSS．8．36 核盘菌菌核形成相关蛋白ss_s12功能研究2．3．4转化子单孢分离物删基因Southern杂交分析为进一步研究删基因在核盘菌：有性阶段的遗传情况，以删基因序列全长作为探针，对部分转化子及其单胞分离物进行了Southern杂交验证。Southern杂交显示所有转化子的结果为阳性，而转化子的单孢分离物却没有杂交信号(图2．6)，表明HPH在核盘菌有性阶段发生丢失，不能稳定遗传。12345678910121314151617图2．6转化子单孢分离物HPH基因Southern杂交验证泳道1：TFSS．4；2：TFSS．6；3：TFSS．8；4．8：TFSS．4单孢分离物；9．13：TFSS．6单孢分离物；14．17：TFSS．8单孢分离物。Fig．2．6ConfirmationofHPHgeneinsingle—ascosporeisolatesoftransformantsbySouthernblotLinel：TFSS-4；2：TFSS一6；3：TFSS一8；4-8：single—ascosporeisolatesofTFSS-4；9—13single—ascosporeisolatesofTFSS一6：14—17：single-ascosporeisolatesofTFSS一8．3结论与讨论3．1结论本研究初步建立了农杆菌介导的核盘菌菌丝遗传转化方法，该方法操作简便，转化效率稳定，为深入研究核盘菌致病及菌核形成等相关基因的功能建立了良好的平台。本研究发现潮霉素磷酸转移酶基因在转化子无性阶段能稳定遗传，但在有性后代中发生缺失。3．2讨论与其它重要的植物病原真菌如稻瘟菌、镰刀菌、灰霉菌等相比，从分子水平对核盘菌生长发育调控及致病机理的研究较浅，特别是对菌核形成、致病等相关基因37 华中农业大学2012届博士研究生学位论文的功能研究仍然很少。一个重要的原因是核盘菌的遗传转化较为困难，其不能产生分生孢子，一般只能以原生质体，菌丝碎片或者子囊孢子作为受体进行转化，限制了对其开展分子生物学研究。2003年，Rollins建立了PEG介导的核盘菌原生质体转化方法，并利用该方法对核盘菌的一些功能基因进行了研究。但是核盘菌原生质体制备过程复杂，以原生质体作为受体进行转化易受外界条件的影响，转化效率不稳定。Weld等(2006)建立了农杆菌介导转化核盘菌子囊孢子的方法，其转化效率较高，达到10。6转化子／子囊孢子。但是该方法有一些不足之处，如诱导子囊孢子产生所需时间较长，且部分菌株在人工条件下难以产生子囊孢子，制约了该方法的应用。本实验室江明(2007)建立了农杆菌介导转化核盘菌菌丝碎片的方法，该方法操作较为繁琐，菌丝碎片制备过程易受杂菌污染，且转化效率不稳定。本研究对农杆菌介导转化核盘菌菌丝碎片的方法进行了改进，以菌丝代替菌丝碎片作为受体直接进行转化，并成功获得了转化子。改进后的转化方法避免了将菌丝研磨或者搅拌成碎片的过程，操作较为简便，同时转化效率较稳定，平均每个选择性平板能获得1．3个转化子，为开展核盘菌基因功能的研究建立了良好的平台。借鉴此方法，本实验室建立了农杆菌介导的三叶草核盘菌(&trifoliorum)菌丝转化方法并成功获得了转化子(未发表)。目前为止还有许多丝状真菌由于不能产生分生孢子，其遗传转化体系尚未建立或者只能以原生质体作为受体进行转化，如水稻纹枯病菌等，本研究将为探索这些真菌的遗传转化方法提供有益的借鉴。尽管本研究建立的核盘菌转化体系具有操作简便，转化效率稳定等优点，但是与其它真菌的遗传转化体系相比，特别是与以分生孢子作为转化受体的真菌如稻瘟菌、灰霉菌等相比，该转化方法转化效率仍然较低，难以满足建立大规模突变体库的要求，因此需要对此体系的各种条件进行优化，如农杆菌的浓度、AS的浓度、共培养的时间、共培养时菌丝的生长状况等，以进一步提高转化效率。本研究发现潮霉素磷酸转移酶基因在核盘菌有性阶段不能稳定遗传，出现了基因丢失的现象。由于转化子菌核萌发形成的子囊柄能够在抗性平板上正常萌发形成菌丝(结果未显示)，因此推测删基因的缺失可能是发生在核盘菌子囊孢子形成时期即有性繁殖阶段。一般认为外源基因整合到受体染色体中后会以孟德尔遗传的方式向子代中遗传，但是研究发现在一些转基因事件中，外源基因在有性后代中出现一定频率的丢失，表现为非孟德尔遗传的方式。Spencer等(1990)分析转基因玉米后代遗传分离时发现部分菌株中的筛选基因(bar)和非筛选基因(gus)均出现丢失。Srivastava等(1996)对6个转基因小麦株系后代的遗传分离进行分析，发现 核盘菌菌核形成相关蛋白Ss-S12功能研究有一个株系中外源基因发生丢失。Paszkowski等(1984)在烟草中也发现类似的现象。推测在核盘菌中也存在外源基因以非孟德尔方式遗传的现象，但是在其它真菌中还未见报道。到目前为止对外源基因在核盘菌有性后代中的丢失机理还不清楚，有待于进一步的深入研究，对该现象进行研究将有助于深入理解真菌的遗传机制。39 华中农业大学2012届博士研究生学位论文第三章核盘菌菌核形成相关蛋白Ss．S12功能研究菌核在核盘菌生活史和菌核病病害循环中起着十分重要的作用，深入研究菌核的形成机理将为控制菌核病提供线索。核盘菌遗传转化体系的建立和全基因组测序的完成为从分子水平研究菌核形成的机理提供了有力的平台。到目前为止，已有一些基因被证实与菌核形成相关，这些基因涉及到细胞内多个重要的信号转导途径，如cAMP．PKA、Ras／MAPK途径等(Rollins，2003；Cheneta1．，2004；Juricketa1．，2004；Chen&Dickman，2005；Erentaleta1．，2007；Jurick&Rollins，2007)，表明菌核的形成受这些重要的信号转导途径调控，但是对作用在其下游的一些重要的结构蛋白或者酶的功能尚不清楚。为深入研究核盘菌菌核的形成机理，本实验室前期利用Illumina-Solexa技术构建了核盘菌菌丝生长和菌核形成阶段的基因表达谱。根据该表达谱的结果，一些基因的表达量在菌核形成阶段显著性升高，推测这些基因可能与菌核发育密切相关。其中一个基因Ss—S12(SSIG_05917，XM一001592945)的mRNA表达量在菌核形成阶段大约升高了400倍，本章将运用RNAi等方法对该基因的功能进行初步研究。1材料与方法1．1材料1．1．1菌株及培养方法Rosetta(DE3)：用作蛋白原核表达的宿主，于37℃或25℃用LB液体振荡培养或固体静置培养，在含有20％甘油的LB液体培养基中．70℃保存。1．1．2质粒及载体pET22(b+)(Ampr)：用于构建目标蛋白的大肠杆菌原核表达载体：pCIT(Amp‘)和双元载体pCH(Karlar)：用于构建基因沉默载体；均为本实验室保存。 核盘菌菌核形成相关蛋白Ss-S12功能研究1．1．3酶、试剂盒及其它试剂碱性磷酸酯酶标羊抗兔IgG(AP．IgG)、DAB辣根过氧化物酶显色液、5-溴-4一氯．3．吲哚．磷酸盐(BCIP)为Promega公司产品；胶体金标记羊抗兔颗粒(10nm)为Bioeell公司产品；cAMP、弗氏完全和不完全佐剂、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、乙酰丁香酮(AS)、乙磺酸钠购(MES)自Sigma公司；eDNA合成反转录试剂盒为Ferment公司产品；SYBRGreenRealtimePCRMasterMix荧光定量PCR试剂盒为Toyoba公司产品；其它各种化学试剂为国产化学分析纯。1．2方法1．2．1Ss．S12蛋白结构分析蛋白同源比对采用BLASTp在线软件(blast．ncbi．nlm．nih．gov／Blast．cgi)，蛋白质信号肽分析采用SignalP3．0软件(www．cbs．dtu．dk／services／SignalP／)(Bendtseneta1．，2004)，蛋白糖基化位点预测采用NetNGlyc1．0软件(www．ebs．dtu．dldservices／NetNGlyc／)(Guptaeta1．，2004)，蛋白质二级结构同源比对和预测分别采用HHpred(toolkit．tuebingen．mpg．de／hhpred)和PSIPRED软件(bioinf．cs．ucl．ac．uk／psipred／)，氨基酸序列比对采用ClustX软件。1．2．2Ss-S12基因原核表达载体的构建以Ss-S12基因的eDNA为模板，设计特异性引物Pet22-S12FP(CGl巡幽巡AATCCGTTCCTCAAACCTC)和Pet22一S12RP(CCG!囝匮鱼△垒GTATGATGTGTAACCATCGGC)扩增Ss-S12编码17．352位氨基酸的eDNA序列(去除N端信号肽)，两边分别加上Sail和XhoI酶切位点(见引物划线处)。用DNA回收纯化试剂盒回收并纯化PCR产物。PCR产物经Sa／I和XhoI双酶切后，连接至原核表达载体pET22(b+)并通过热击转化导入大肠杆菌JMl09中，酶切鉴定阳性克隆，测序验证读码框的正确与否，将最终的阳性克隆命名为pET22-S12。1．2．3Ss一。锄基因在大肠杆菌中的诱导表达将重组质粒pET22-S12通过热击转化导入大肠杆菌原核蛋白表达菌株Rosetta4l 华中农业大学2012届博士研究生学位论文(DE3)中，挑取转化子，经PCR验证为阳性克隆后将菌株保存。将菌株在LB固体培养基上划线于37℃过夜培养。挑取单菌落于2mlLB液体培养基中振荡培养至OD600为0．4-1。取培养好的菌液500山于50mlLB培养基中振荡培养3h。加入IPTG至浓度为1mM，25℃振荡培养2．10h。取1rnl菌液离心去上清，加入1×SDS上样缓冲液，于100℃沸水中水浴5．10min。水浴后短暂离心，取20肛l上清进行SDS-PAGE电泳检测。1．2．4Ss—S12基因原核表达蛋白的SDS．PAGE分析采用SDS-PAGE检测原核表达的蛋白，方法如下：清洗玻璃板并将其安装在绝缘橡胶带中，用1％琼脂糖封底。将封好后的玻璃板和胶带固定于电泳装置中。将制好的12％分离胶仔细加入到两玻板的间隙中，留出灌注浓缩胶所需空间，并在分离胶上加入高度为1cm的正丁醇，于温室静止30rain。待分离胶聚合后，去除正丁醇液体，用蒸馏水清洗凝胶项部数次，并用滤纸片吸净残留液体。将制好的5％浓缩胶加入分离胶上，立即插入梳子，于室温静止10min，待胶全部聚合后拔出梳子，加电泳缓冲液。每孔上样10．20LLl，于80V电压下电泳直至溴酚蓝指示剂迁移至分离胶时，将电压调到100V。电泳完成后，取出凝胶，切去浓缩胶，用蒸馏水冲洗分离胶。作检测用的分离胶用0．25％(v／v)考马斯亮蓝室温染色3h以上，取出放入脱色液中脱色2h以上，直到显现出清晰的蛋白条带为止；抗体制备用的分离胶用预冷的O．25MKCl处理5min，然后用锋利刀片切下目的蛋白条带。1．2．5抗血清的制备及采集为获得Ss—S12原核表达蛋白的抗体，用制备的目标蛋白免疫新西兰大耳兔。免疫前先静脉取血1IIll制备少量正常血清。第一次免疫时称取约0．5mg的原核表达目标蛋白，用1xPBS研磨，再与等体积的弗氏完全佐剂进行混合乳化。一周后进行第二次免疫。第二次免疫蛋白量减半，并向目的蛋白中加入等体积的弗氏不完全佐剂进行乳化。两周后进行第三次免疫，所用的蛋白量与处理方法同第二次，随后的几次加强注射不加入佐剂直接免疫。注射方法为背部皮下多点注射及肌肉注射，最后一次注射后的1-2周心脏采血。大耳兔在采血前数小时进行禁食，采集心脏血样置于经灭菌的离心管中，于3742 核盘菌菌核形成相关蛋白Ss-S12功能研究。C放置1．2h使之凝固。用封口的巴斯德吸管旋动凝血块即沿管壁旋松凝块，置于4℃静止数小时，血凝块会逐渐缩小并溢出淡黄色的抗血清。将抗血清转移到另一离心管，然后于室温将血凝块于6000rpm离心10min。吸出上清液合并于先前收集抗血清的试管中，丢弃血凝块。1．2．6间接ELISA测定抗血清的效价采用间接ELISA(IndirectELISA，ID．ELISA)测定抗血清的效价，所用抗原为据本章第1．2．3节方法所制备的Ss-S12大肠杆菌原核表达蛋白，抗原浓度为首次免疫注射时的抗原浓度的1／500，阴性血清为未免疫的大耳兔血清，将血清按倍比稀释，空白以PBST代替血清，具体操作步骤如下：将抗原用碳酸包被缓冲液稀释后于每个酶联孔中加入100山，4℃过夜，PBST冲洗缓冲液洗3次，每次5min。每FLN入5％的脱脂奶粉(用PBST稀释)100山，37℃封闭1h，用PBST冲洗3次，每次5min。加入用PBST倍比稀释的抗血清，每孔100出，37oC封闭1h，用PBST冲洗3次，每次5min。加入用PBST稀释至5000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔HRP．IgG，每孔100山，37oC封闭1h，用PBST冲洗3次，每次5min。加入辣根过氧化物酶体底物显色液，每孔100¨l，室温下遮光放置至显色。每孔加入50“l2mol／L的硫酸终止反应，然后用550型酶标仪(BIO．凡奶)测定波长在450nill下的吸光值。1．2．7Western杂交分析为验证所制抗体的特异性，对核盘菌总蛋白进行Western杂交分析。核盘菌总蛋白的提取参照Harel等(2005)：将核盘菌菌株于铺有玻璃纸的PDA培养基中培养4d。称取0．3g菌丝于液氮中研磨，加入1IIll的蛋白提取缓冲液，并补充适量的PMSF，于振荡器上振荡混匀。冰浴40mill后10000g离心40min，上清即为核盘菌总蛋白，于．20。C保存。取50岭的核盘菌总蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，以IPTG诱导的大肠杆菌Ss．S12蛋白原核表达菌株总蛋白作为对照。SDS—PAGE电泳见本章第1．2．4节。为通过Western杂交分析Ss．S12的细胞定位，分别提取核盘菌的细胞壁蛋白和细胞质蛋白。提取方法参考Pitarch等(2002)和张成省等(2004)，具体步骤如下：将核盘菌菌株于铺有玻璃纸的PDA培养基中培养3d，收集菌丝于液氮中研磨至百43 华中农业大学2012届博士研究生学位论文色，加适量的裂解缓冲液，于冰水浴中用超声波细胞破碎仪处理80次，每次间隔2s，功率150W。菌丝细胞壁经上述步骤后可充分破裂，细胞质完全释放出来。5000rpm离心10rain，收集上清，即为细胞质总蛋白。用蒸馏水溶解、震荡以充分清洗下层沉淀，然后离心，反复多次至上清液变澄清为止，沉淀即为菌丝的细胞壁。加入适量SDS蛋白提取缓冲液于细胞壁中，100℃水浴15min，重复一次。12000rpm离心20min，取上清，即为细胞壁蛋白，样品于．20℃保存。分别取50岖的细胞壁蛋白和细胞质蛋白样品进行SDS．PAGE电泳。SDS．PAGE电泳见本章第1．2．4节。电转移：剪一块与膜大小一致的PVDF膜，PVDF膜在甲醇中漂洗5s后用蒸馏水浸泡5rain，PAGE胶、滤纸和海绵在转移缓冲液中浸泡10rain。将2张滤纸铺盖到海绵垫上，将PAGE胶小心放在滤纸中央，并赶走气泡，使二者充分接触，于凝胶上覆盖PVDF膜，小心去除气泡，然后再加上2块滤纸，最后放上另外一层海绵垫。在电转仪中加满转移缓冲液，PAGE胶接负极，PVDF膜接正极。将电转仪放入加有冰水混合物的冰盒中，35V转移2h。免疫显色反应：将膜晾干，放入5％脱脂奶(PBST溶解)中，室温封闭2h或者4oC过夜。用PBST洗涤3次，每次5min。按1：500比例用5％脱脂奶(PBST溶解)稀释抗血清，将膜放入37℃孵育2．3h。用PBST洗涤3次，每次5min。将膜放入按1：500比例用5％脱脂奶(PBST溶解)稀释的AP．羊抗兔IgG中37℃孵育2．3h。用PBST洗涤3次，每次5min。加入BCIP／NBT显色液显色，一旦紫色条带出现立即用蒸馏水冲洗以终止反应。1．2．8Ss．S12蛋白免疫胶体金定位分析蛋白亚细胞定位分析采用免疫胶体金标记电镜方法，方法参考康振生(1995)。具体步骤如下：样品组织树脂包埋块的制备：分别从核盘菌菌丝生长初期及后期的菌丝组织、菌核形成初期及后期的绒毛团组织和成熟菌核上取下1rnrnx1millx2turn小长条形的目的样品于4％戊二醛固定液中固定6h，固定完后用0．1％的PBS漂洗3次，每次5-15rain。然后用1％锇酸固定2h，再用0．1％的PBS漂洗3次，每次5．15min。将固定好的样品先用不同浓度的乙醇逐级脱水，即30％乙醇脱水15min、50％乙醇15rain、70％乙醇15rain、80％乙醇20min、90％乙醇20min、100％乙醇30rnin。然后用无水丙酮脱水2次，每次30min。将样品置于丙酮和包埋剂EponSl2先后按以下比例的混合物中进行渗透，其中丙酮：包埋剂=3：1渗透2h，丙酮：包埋N=I： 垫垄堕堕鳖垂丝塑羞至旦兰!：坠丛巫壅-_____-_-_____-_-___-_--●_________-____●●________●-_____-_____I___--_-l____■-___-________l_l_-___-__。。。___。。。。’——————————————一一一1渗透6h，丙酮：包埋剂=1：3渗透12h。将样品置于包埋孔，加入包埋剂进行包埋；然后将包埋块放入烘箱里，先于30。C烘24h，然后于60oC烘48h。免疫胶体金反应：将包埋块于切片机上进行超薄切片，并将切片置于铜网的膜面上。铜网于1％BSA室温下封闭2次，每次0．5h；然后将其置于1／500的一抗(1％BSA稀释)中室温孵育2h；孵育结束后用1％BSA和TBS各清洗3次。将铜网置于1／40的胶体金标记羊抗兔颗粒(TBS稀释)中，室温孵育2h。用TBS和ddH20各清洗5次。用2％的醋酸双氧铀将铜网染色15min，ddH20清洗3次，每次10min。将铜网置于厄M．1230透射电子显微镜下观察并拍照。1．2．9Ss—S12基因在菌核发育不同阶段的表达分析为研究Ss-S12在核盘菌菌核形成不同阶段的表达情况，以核盘菌actin基因作为对照，对其进行Real-timereverse—transcription(RT)-PCR分析，具体方法如下：将新鲜的核盘菌接种于覆盖玻璃纸的PDA上培养，分别收集培养1d、2d、3d、4d、5d、6d和7d的菌丝，用TRIzol试剂分别提取总RNA，并用DNAase处理总RNA。用ReventAidTMFirstStrandeDNASynthesisKit反转录试剂盒合成eDNA第一链。具体步骤如下：在无菌0．5mleppendorf管中加入2ul的总RNA(约1腭)，1ul的Oligo(dT)18Primer，9ulddH20，混匀并短暂离心，于72℃下放置5min后迅速置于冰上2min，然后依次加入4B15×ReactionBuffer，2山dNTP(10mM)，l111RNaseInhibitor和1“lReverseTranscriptase(200u／山)，轻轻混匀后置于42℃下孵育1h，于70℃水浴5min以终止反应，所得产物于-20℃保存。根据Ss-S12和actin基因序列设计特异性引物：RT-S12F(5'-GAAACACCGTGACAGCGAG．3’)、ImSl2R(5'-GCCCATTTCCAGCAGGT．3’)、RT-actinF(5'-GAGCTGTTTTCCCTTCCATTGTC．3’)和RT-actinR(5’-GACGACACCGTGCTCGArTGG．3’)。以核盘菌eDNA为模板，进行Real．timeRT-PCR扩增，反应总体积为20山。反应体系如下：2xSYBRGreenRealtimePCRMasterMix10山，正／反向引物浓度各0．4州，eDNA模板1山，ddH208．2山。反应程序如下：95oC2rain(1cycle)：95oC20sec，56。C15SCC，72oC20SCC(40cycles)；16。C30sec(1cycle)。45 华中农业大学2012届博士研究生学位论文1．2．10外源cAMP对Ss—S12基因表达水平的影响将新鲜的核盘菌菌丝块置于添加5mMcA]VIP的YPSS培养基中振荡培养，以不加cAMP的YPSS培养基作为对照。分别收集2种条件下培养3d和5d的菌丝，提取总RNA，用Real．timeRT-PCR方法检测不同处理下的Ss-S12基因的表达情况。Real-timeRT-PCR具体步骤见本章1．2．9。1．2．11环境pH对Ss-S12基因表达水平的影响将新鲜的核盘菌菌丝块置于YPSS培养基中振荡培养4d，经布氏漏斗过滤并收集菌丝，用无菌水将菌丝清洗3次。将收集的菌丝分别置于pH3和pH7的0．1M柠檬酸一磷酸盐缓冲液中振荡培养1d，收集菌丝，提取总RNA。采用Real．timeRT-PCR方法检测不同处理下的Ss-S12基因的表达情况。Real—timeRT-PCR试验具体步骤见本章1．2．9。1．2．12Ss．S12基因沉默载体的构建为研究Ss-S12基因的功能，构建了Ss-S12的RNAi沉默载体。将Ss-S12cDNA序列的同一部分以正反两个方向连至一个内含子的两端，并置于PtrpC启动子的控制下，构成了发卡环状的RNAi结构。具体方法如下：于核盘菌基因组中搜索Ss-S12的同源基因，并比对它们之间的序列差异，选取Ss-S12cDNA中特异性的片段。设计引物Sisl2F(5'-CCC丛鱼￡!至￡!Q￡△鱼CAGCTTTCGAAGC-3’)和Sisl2R(5'-CC△I￡堑：苎匹鱼匿b选￡￡AATAAGCCACCGAA一3’)，以核盘菌eDNA为模板，扩增此310bp的片段，并在引物两边分别加上酶切位点HindIII、风Ⅱ、BamHI和ClaI(引物下划线处)。PCR产物经DNA回收试剂盒回收纯化后用nfI和BamHI酶切处理。酶切产物用乙醇沉淀、晾干，重新溶解于TE，通过连接酶连接到用相同酶切的质粒pCIT上，得到pCITl。将上述回收纯化后的PCR产物经HindlII和ClaI酶切处理。酶切产物用乙醇沉淀、晾干，重新溶解于TE。通过连接酶把酶切产物连接到用相同酶切的质粒pCITl上，得到pCIT2。用XhoI和SacI酶切质粒pCIT2，回收纯化2．2kb大小的片段，用连接酶连接到经相同酶切的质粒pCH上，把得到的阳性克隆命名为pSisl2，即为Ss-S12基因沉默 核盘菌茵核形成相关蛋白SsoSl2功能研究载体(图3．1)。}b阿阀Kanaml，cin网图3．1RNAi特异性沉默Ss-S12的载体图谱Fig．3．1ThevectormapforRNAispecificallysilencingSs-S121．2．13Ss—S12基因沉默转化子的获得将构建的载体沉默载体pSisl2通过热击转化导入农杆菌菌株EHAl05中，用以转化核盘菌野生型菌株Sunf-M，转化方法见第2章第1．2．1节。将获得的部分转化子活化后接种于铺有玻璃纸的PDA上培养5d，收集菌丝并提取总RNA，以出发菌株作Sunf-M为对照，用Real．timeRT-PCR的方法检测转化子中Ss-S12基因的表达情况。Real-timeRT-PCR中所用引物及具体方法见本章第1．2．9节。1．2．14Ss-S12基因沉默转化子的形态特征观察将核盘菌转化子活化后接种到PDA平板中央，20℃培养15d后观察菌落形态。每皿15mlPDA培养基，每个处理3次重复，以出发菌株Sunf-M做为对照。1．2．15＆$眩基因沉默转化子菌核内部超微结构观察转化子茵核内部超微结构于透射电镜下观察，透射电镜超薄切片的制作与观察方法见本章第1．2．8节。47 华中农业大学2012届博士研究生学位论文1．2．16Ss—S12基因沉默转化子的生长速度分析在新鲜的转化子菌落边缘打取直径为7rnnl的菌丝块接种至PDA平板中央，每皿15mlPDA培养基，每个处理三个重复。将平板置于20℃培养，用十字交叉法每隔24h测定菌落直径并计算菌丝生长速度。以核盘菌Sunf-M菌株为对照。用SASS软件进行差异显著性分析。1．2．17Ss—S12基因沉默转化子的致病力分析采用油菜(富油668)及番茄(华番2号)离体叶片接种法。在托底瓷盘内平铺吸水纸，并用无菌水喷湿，选取大小一致的嫩绿叶片于正面朝上放置于吸水纸上。在活化好的转化子菌落边缘打取直径为5I砌的菌丝块，接种到叶片靠近主脉的地方，每个叶片接种一个菌丝块，每个转化子接种5片叶片。接种完毕后喷洒无菌水保湿。托底瓷盘用塑料薄膜密封，在20℃保湿培养。以核盘菌Sunf-M菌株为对照，72h后观察并测量病斑直径。1．2．18Ss-S12基因沉默转化子维持细胞完整性能力测定为测定Ss—S12沉默转化子维持细胞完整性能力是否受损，检测了高渗条件和山梨糖对Ss-S12沉默转化子菌丝生长的影响。分别在PDA培养基中添加2％和5％的山梨糖、5％NaCl、lM山梨醇和1．2M蔗糖。在不同的处理下分别培养核盘菌野生型菌株Sunf-M和Ss-S12沉默转化子，以PDA培养基作为对照，采用十字交叉法测定不同处理下的菌丝生长速度，计算菌株Sunf-M和Ss-S12沉默转化子在不同的处理下的菌丝生长抑制率，同时观察不同处理下Sunf-M和Ss-S12沉默转化子的菌丝形态。1．2．19核盘菌黑色素合成相关基因克隆及表达分析为分析Ss-S12沉默转化子中黑色素合成相关基因的表达情况，克隆了核盘菌聚酮合成酶基因(PKS)。研究表明核盘菌通过二羟基萘(Dihydroxynaphthalene，DHN)途径来合成黑色素，聚酮合成酶催化该途径的第一步反应(Lazarovitsata／．，2000；Starrateta1．，2002；Langfelderela1．，2003；Butlereta1．，2009)。以构巢曲霉聚酮合成酶基因pksP(Langfeldereta1．，1998)为模板对核盘菌基因组进行BLAST同源比对分 核盘菌菌核形成相关蛋白Ss-S12功能研究析，获得核盘菌中pksP的同源基因Ss-Pksl。为通过Real-timeRT-PCR分析&一册沉默转化子中Ss-PksI基因的表达，设计引物RT-Ss·PkslFP(5’-ACTGCTACGCCGAAACCATC．3’)和RT-Ss-PkslRP(5'-CGCATAGGACCTGCCAACTC．3’)。Real．timeRT-PCR具体步骤见本章1．2．9。2结果与分析2．1Ss．S12蛋白结构分析鼬姚基因具有4个外显子和3个内含子，编码区全长1059bp，编码352个氨基酸。SignalP3．0预测结果表明Ss．S12蛋白的N端(1．16aa)具有一个典型的信号肽结构，推测其可能为分泌性蛋白。NetNGlyc1．0预测结果显示该蛋白具有两个可能的N端糖基化位点，分别位于NLSD和NTTT残基处，表明其可能为糖蛋白(图3．2)。在NCBI上进行BLAST比对显示Ss．S12的同源蛋白主要存在于一些子囊菌中，如灰霉菌、粗糙脉胞菌、希金斯炭疽菌(Colletotrichumhigginsianum)、禾生炭疽菌(Colletotrichumgraminicola)、小麦颖枯病菌(Phaeosphaerianodorum)、小麦壳针孢(Mycosphaerellagraminicola)、小麦褐斑病菌(Pyrenophoratritici-repentis)、油菜黑胫病菌(Leptosphaeriamaculans)、大麦网斑病菌(Pyrenophorateres)等(图3．3)，其中同源性最高的为灰霉菌中的BClG12455蛋白(XP001549047)，其与Ss．S12氨基酸序列相似性高达90％(E值为3e．161)。此外，在核盘菌中还存在另外3个与Ss．S12同源的蛋白，所有的这些同源蛋白在NCBI数据库中均被注释为功能未知。利用多种蛋白质结构域分析软件如Pfam、Smart、ProSiteScan等对Ss．S12蛋白进行分析后均未发现保守的蛋白结构域，通过蛋白质二级结构在线比对软件HHpred对Ss．S12的二级结构进行分析后发现其可能存在两个保守的蛋白模块，分别命名为Ss．S12D1(138．225aa)和Ss．S12D2(256．336aa)。其中与Ss．S12D1二级结构最为相似的是人肝细胞生长因子(HGF)中的PAN模块，其E值为0．76(P值3E-05)，可能性分值(probabilityscore)达到79．2；其次是人血液凝固因子10(FXI)等中的PAN模块，E值为2．4(P值9．4E．05)，可能性分数为73．7。与Ss—S12D2二级结构最为相似的同样是FXI中的PAN模块，E值为3．7(P值0．00014)，可能性分数为63．7。如图3．4显示，Ss．S12D1和Ss．S12D2与FXI蛋白的PAN模块在二级结构(0【螺旋和B折叠)的类型和位置上均高度一致。将Ss-S12D1和Ss—S12D2结构域的氨基酸序列与其它蛋白如根瘤菌m119167蛋白、寄生疫霉CBEL蛋白、柔嫩艾美耳球49 虫微线体蛋白EtMIC5、人血纤维蛋白溶酶原、人肝细胞生长因子、人前激肽释放酶和人凝血因子10等的PAN模块进行比对，结果表明均存在4个保守的半胱氨酸，符合已报道的PAN模块的特土76垒S土515工2267S30i10王37‘126毒5iiSl52617薯601201‘，S22675125le2527690130王9，‘32‘105土351点。婪兰兰兰三苎：兰至苎墨苎苎∑苎兰苎辩pFLKpRTL跚gnal"辨m枣DZSAY曩AVPTA童A鬟oApAG麓TVTAS勰酗髂髓龆矾cc强轴优伪谯∞矗盘l掬∞∽％"∞鱼∞∞∞^C矗∞毳凇猷∞cc∞∞能撇C钟ZTY辩pKSVAD▲^VA譬ASVAVZ辩R^毒日Hj～譬A雨aCaCAaE黛正习只P学譬Ct奢函·I踊C孵呵佻GC警O∞'曙^CC'喝|c习X；鼯再矗警aaaCC冒矗日嚼婚曙℃^^C^a氍∞囊簋式R套TC工．STCALPA辔NGP藏VNSpDT矗AFEADL蔓圣璺曼ALNAvTpPGYN-蜘'co％vlationsiteGTTCGTGTCGATGGCTTTC．AAAACGTTCACOCCGCTGCTGAATCCGCCACATACTTGACATATATCTCCGACTCTV冀V奎尊量QNV毫A^A童SATY五警Y士SDSCTC圆心×就如：望t叠CG鹊薯CC气I《Kl：毒譬f蕾G惶唱}CC高矗髫托再TOC禹南j辨AC^譬AC^茜a瘩C翟∞ACC瞿C=c曩竹矗商T南TC鼍!’噬LTSYDPAZCA冀ACNDZQ鸯CTSFNZF毫RD争TVApDVDCp辩pSQTL芏KCSLFGLD孥S五A基NGQF§ADPQVZ^盘sNAY辩^VAPpA工QGY0GVQD亨G譬▲TzDAp氛罂篓笺兰YM岱VEAFPQTQ奢YN-glycosylationsite翻懂代满瓤搿翻陀髑蹿联强0cc，0蕊戳la虻尘能囊^奢赫0重葛囊cc=c翻站期坞戳苷e铡舶0鞭∞譬例雌燃囊警^杈：t曩嘧DpTVCACTAKSNp当CAFVSYxLY葛HG翼辩GVFTCTYFTVSX鸯SD取^ZE量口盘￥D#Q唪辩嚣Y警ZG冀5F0亨TADGYTtC^誉^C警^8S?o图3．2核盘菌ss-s也蛋白氨基酸序列分析Fig．3．2TheaminoacidsequenceanalysisofSs-S12proteinin＆sclerotiorum 图3．3Ss．Si2系统发育分析核盘茵Ss．S12蛋白与来自灰霉菌、粗糙脉胞菌、希金斯炭疽菌、禾生炭疽菌、小麦颖枯病菌、小麦壳针孢、小麦褐斑病菌、少孢节丛孢菌、油菜黑胫病菌、大麦网斑病菌等中的同源蛋白进行系统发育分析。利用软件MEGA(版本5．01)的临近节点算法进行系统发育分析。经1000次重复运算根值，图中只标示大于50％的根值，标尺表示的是分支长度对应的每个节点的替换数。图中黑色的菱形分别表示Ss-S12。Fig．3．3PhyiogenetieanalysisofSs-S12PhylogeneticanalysisofSs-S12withselectedhomologyproteinsfromBotryotiniafuckeliana,Neurosporacrassa,Colletotrichumhigginsianum，Colletotrichumgraminicola,Phaeosphaerianodorum，Mycosphaerellagrarainicola,Pyrenophoratritici-repentis，Arthrobotrysoligospora,Leptosphaeriamaculan&Pyrenophorateres，andSOon．PhylogeneticanalysiswasconductedusingMEGAversion5．01withNeigbhot-joiningalgorithm．Bootstrapvalueswerecalculatedfrom1000bootstrapreplicates．Onlybootstrapsupportvaluesof>50％areindicated．Thescalerelatesbranchlengthstothenumberofsubstitutionspersite．TheblankrhombusindicatesSs-S12．51 华中农业大学2012届博士研究生学位论文霜王19167C髓Lg散墨tMZC5EBFP1asmiDo口eNSPl氍FX工$s-S12D1Ss-S12D2薯獬掌翟孽堪SS-S工2D1P茸edgS-S12D2P￡囊哇撕王19167C嫩SG2置tMZCS撇P1asminogeMSP翘【FX工Ss-S12DlSS--S12D2FXZPredSs-S12DlPredSS-S12D2P￡鲁d★20★40★60一,s．u觞TA---鬻⋯翻⋯---麴囊I一一-LA毫一謦：：嚣Yz硐圆一_一⋯一⋯一_-葛墨⋯一葛4E隅-】晦一一_嚣⋯肿⋯一t·捆渣玎窿窝麒H_一一⋯一_·薯躔翻埔露-⋯】蠊-⋯⋯⋯一-髓E-_霉重Il翻巴⋯⋯-嚣⋯⋯⋯-嚣丑麟腿⋯⋯⋯-_置露8E-_啦置⋯⋯一⋯_⋯-霉罐；幕纛⋯一一⋯一嚣⋯一⋯⋯嚣嚣嚣凄秘鞠稠隰⋯·⋯一--窭簿臻嚣鞫墨曩量；l薹霉●80★lOO★⋯⋯⋯一_⋯⋯·一驾蓦墨霸露墨-⋯⋯一-薯葛离幂⋯譬葛⋯⋯-⋯⋯一⋯_⋯⋯一一E墨翟疆留瞄墨⋯⋯一⋯一⋯一一⋯墨E蓬：E·_⋯_⋯-⋯_⋯⋯-墨嚣墨瑾盟建墨-葚E鐾⋯⋯⋯墨霉⋯__⋯图3．4Ss．S12D1和Ss．S12D2与其他PAN模块的氨基酸序列多重比对及二级结构分析P删模块选自于根瘤菌mil9167蛋白(m119167，BAB54559，氨基酸残基11％194)、寄生疫霉CBEL蛋白(cBEL，CAA65843，氨基酸残基197．268)、柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白5(EMIC5，CAB52368，氨基酸残基713．781)、人巨噬细胞刺激蛋白(MSP，BAHl2774，氨基酸残基21．105)、人血纤维蛋白溶酶原(Plasminogen，AAA36451，氨基酸残基20．98)、人肝细胞生长因子(Plasminogen，AAA36451，氨基酸残基20—98)、人前激肽释放酶(PK，AAY40900，氨基酸残基21．103)、人凝血因子10(FxI，AAA51985，氨基酸残基20．103)。保守的氨基酸以灰色显示，FXI、Ss．S12D1和Ss．S12D2中PAN模块的二级结构由PSIPRED预测并在最后3行显示。Fig．3．4MultiplealignmentofsequencesandpredictedsecondarystructuresofSs-S12D1，Ss-Si2D2andrepresentativePANmodnlesTheselectedPANmodulesarefromaMesorhizobiumlotim119167protein(m119167，BAB54559，residues17-194)，PhytophthoraparasiticaCBELprotein(CBEL，CAA65843，residues197-268)，Ipomoeatrifidasecretedglycoprotein2(SG2，AAA97902，residues348—425)，Eimeriatenellamicronemeprotein5(EtMIC5，CAB52368，residues713-781)，humanmacrophagestimulatingprotein(MSP,BAHl2774，residues21-105)，humanplasminogen(Plasminogen，AAA3645l，residues20-98)，humanhepatocytegrowthfactor(HGF,AAA52648，residues37-123)，humanprekallikrein(PK，AAY40900，residues21-103)，andhumancoagulationfactorXI(FXI，AAA51985，residues20-103)．Conservedaminoacidsarcshown诮廿lashadedbackground．Thesecondarystructuralelements(Hforu-hex,Efor13-stand)fromthePAN／AppledomainsofFXI(FXI_Pred)，Ss—S12D1(Ss-S12DI_Pred)andSs—S12D2(Ss-S12DI_Pred)predictedwimthePSIPREDprogramarethelastthreesequencesinthemultiplealignments．52 核盘菌菌核形成相关蛋白ss-s12功能研究2．2Ss．S12蛋白亚细胞定位2．2。1Ss—S12基因在大肠杆菌中的表达扩增Ss—S12cDNA编码17．352位氨基酸的序列，将其通过限制性内切酶Sa／I和XhoI连接到pET22(b+)中，获得重组质粒pET22．S12，测序结果表明Ss．S12已按阅读框连接正确，且未产生突变。将pET22．S12导入到大肠杆菌原核表达菌株Rosetta(DE3)中，经IPTG诱导表达后进行SDS．PAGE电泳发现：与空载体和未经诱导的菌株相比，含pET22．S12的Rosetta(DE3)菌株经IPTG诱导后产生了分子量约36kDa的特异性重组蛋白，大小与预期的分子量相当(图3．5)，表明Ss．S12在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行了正确的表达。M1234567图3．5Ss-S12原核表达产物的SDS．PAGE分析泳道M：蛋白质分子量标准；l：含pET22(b+)的Rosetta(DE3)未诱导的产物；2：含pET22．S12的Rosetta(DE3)未诱导的产物：3．7分别为含pET22．S12的Rosetta(DE3)分别经IPTG诱导2、4、6、8、10h的产物。Fig．3．5SDS-PAGEanalysisofprokaryoticexpressionproductionOf-譬弘·％2LmeM：Proteinmarker；l：productionofRosetta(DE3)containingpET22Co+)withoutinduction；2：productionofRosetta(DE3)containingpET22-S12withoutinduction；3-7：productionofRosetta(DE3)containingpET22．S12inducedwithITPGfor2，4，6，8，10h，respectively．2．2．2&一S12原核表达产物抗体的效价及特异性分析将用于免疫的Ss—S12原核表达蛋白按1：500稀释作为抗原，利用ID．ELISA的方法检测得所制备的Ss．S12多克隆抗体的效价，结果表明该抗体间接ELISA效价为1：51200(图3．6A)。进一步利用所获得的抗体对核盘菌蛋白组进行Western杂交分析，结果显示所制备的抗体在稀释500倍时能与核盘菌的蛋白质起特异性免疫反应(图3．6B)，表明该抗体具有较高的效价和特异性，可以用于下一步的实验。泊95459征84321 华中农业大学2012届博士研究生学位论文A04504O3503幂o25蕞02O1501O050枣誉枣§≯零誉梦≯梦抗血清稀释倍数B12图3．6Ss．S12蛋白抗体的效价(A)及特异性分析(B)泳道I：含pET22-S12的Rosetta(DE3)菌株蛋白；泳道2：核盘菌总蛋白。Fig．3．6Titer(A)andspecificity(B)analysisofanti-Ss-S12antibodiesLinel：TotalproteinsfromRosetta(DE3)strainwithpET22-S12；line2：totalproteinsfromSsclerotioFumstrain．2．2．3Ss．S12蛋白的亚细胞定位分别取核盘菌的菌丝生长初期及后期，菌核形成起始期、后期及成熟的菌核的组织制备超薄切片，利用Ss．S12蛋白抗体对这些组织细胞中的Ss．S12蛋白定位进行免疫胶体金标记研究。结果表明：在菌丝生长初期，少量Ss．S12蛋白均匀分布在菌丝细胞的细胞壁中(图3．7A)；在菌丝生长后期，Ss．S12蛋白的数量有所增加，并分布于细胞壁和隔膜中(图3．7B)；在菌核形成起始期，菌丝相互纠结，形成绒毛状的菌丝团，菌丝团中的菌丝细胞壁外围环绕着一层纤维层，大量的Ss．S12蛋白分布在纤维层上(图3．7C)。在形成后期和成熟的菌核中，细胞壁外围的纤维层黑化并与细胞壁一起形成新的加厚的细胞壁，Ss．S12蛋白均匀分布在加厚的细胞壁上(图3．7D和E)。在用未免疫的血清进行标记的对照中，在菌丝细胞的各个部位均看不到胶体金颗粒(图3．7F)。为进一步研究Ss．S12蛋白的亚细胞定位，分别提取核盘菌菌丝的细胞质和细胞壁的总蛋白利用Ss．S12蛋白抗体进行Western杂交分析，进一步证明该蛋白定位于细胞壁中，如图3．8所示。 图3．7免疫胶体金检测Ss．S12蛋白的亚细胞定位A：菌丝生长初期：B：菌丝生长后期；C：菌核形成初期；D：菌核形成后期；E：成熟菌核；F：阴性对照。W：细胞壁；S：隔膜；WB：沃鲁宁体。标尺为l微米。Fig．3．7SubceilularlocationofSs．S12proteinwithimmunolabellinganalysisA：theinitialstageofhyphalgrowth；B：thelaterstageofhyphalgrowth；C：theinitialstageofsclerotium；D：thelaterstageofsclemtium；E：maturesclerotia；F：negativecontr01．W：cellwall；S：septa；WB：Woroninbody．Bar=llan．55 华中农业大学2012届博士研究生学位论文CCWSs-S12l—■—黼。。m_黛_I铡黼_㈣—毒，I图3．8Western杂交检测Ss．S12蛋白亚细胞定位C：细胞质；CW：细胞壁Fig．3．8SubcellularlocationofSs-S12proteinwithWesternblotanalysisC：cytoblasm；CW：cellwall2．3Ss—S12基因在菌核发育不同阶段的表达分析为深入研究Ss．S12在菌核发育不同阶段的表达情况，在覆盖玻璃纸的PDA培养基上培养核盘菌野生型菌株Sunf-M，分别收集培养1—7d的培养物，提取总RNA并利用Real．timeRT-PCR的方法检测Ss．S12的表达情况。Real．timeRT-PCR结果表明Ss-S12表达量在菌丝生长阶段较低，当培养至第4d即菌核形成起始阶段时表达量显著性升高，继续培养至第5d即菌核凝聚阶段其表达量达到最大，为菌丝生长阶段的470倍。在菌核形成后期和成熟的菌核中，Ss-S12的表达量有所下降，但仍显著高于菌丝生长阶段(图3．9)，表明Ss—S12基因可能与菌核形成密切相关。1234567图3．9Ss-S12在核盘菌不同生长阶段的表达情况Fig．3．9ThemRNAlevelofSs-S12atdifferentgrowthstagesofS．sclerotiorum2．4Ss—S12基因表达调控分析研究表明核盘菌菌核形成受cAIVIP水平的负调控，高浓度的c心P将会抑制菌核的形成(Rollins&Dickman，1998；Jurick&Rollins，2007)。高浓度的cAMP可阻遏Ras—MAPK信号途径的转导，而Ras．MAPK信号途径已被证实在菌核形成过程中起重要正调控作用(Cheneta1．，2004；Chen&Dickman，2005)。Ss．S12在菌核形成阶段表达量显著性升高，推测其可能受细胞内cAI～IP水平的负调控。为验证此推测，在培养基中添加外源的cAIV伊，分别收集培养3d和5d的培养物，以未添加cAMP的O∞鲫轴孙拍佃co一∞啊2av8搴一蔷19篮 核盘菌菌核形成相关蛋白Ss-S12功能研究培养基作为对照，采用Real-timeRT-PCR方法分别检测不同条件下Ss-S12的表达情况。结果表明，在未添加cAMP的条件下，Ss-S12的表达水平在第5天的时候出现上升，而在添加外源cAMP时，Ss-S12的表达水平却没有显著变化(图3．10)，表明Ss-S12的表达水平受cAMP水平的负调控。-cAMP+cAMP-cAMP+cAMP3d5d图3．10cAMP水平对Ss-S12表达水平的影响Fig．3．10EffectsofcAMPlevelOilthemRNAlevelofSs-S12除cAMP之外，核盘菌菌核的形成还受到体内pH信号转导途径的调控。中性或碱性的环境会抑制菌核的形成，而酸性的环境则有利于菌核的形成(Rollins&Dickman，2001)。为研究＆明的表达水平与环境pH值之间的关系，将核盘菌于YPSS培养基中培养4d后重新置于pH3和pH7的缓冲条件下培养1d，通过Real-timeRT-PCR检测Ss—S12的表达水平，结果显示Ss—S／2在pH3和pH7条件下表达水平没有差异，表明Ss-S12的表达水平与环境pH无关(图3．11)。3pH7图3．11pH对Ss-S12表达水平的影响Fig．3．11EffectsofmediumpHOilthemRNAlevelofSs-S125352515O321Oco一田田o-Q)【oo>；母一m茔4218642O1Oco一∞协￡A×口9≯茹弼一。正 华中农业大学2012届博士研究生学位论文2．5Ss-S12基因沉默转化子的获得为研究Ss．S12与核盘菌菌核形成之间的关系，构建了鼬靴的RNAi沉默载体pSisl2。如图3．1所示，将Ss-S12cDNA序列的同一部分以正反两个方向连至内含子两端，并置于PtrpC启动子的控制下，构成了发卡环状的RNAi结构。将pSisl2通过农杆菌介导转化的方法导入到核盘菌野生型菌株Sunf-M中，选择部分转化子于PDA培养基上培养5d后提取总RNA，利用Real-timeRT-PCR的方法检测&圾2的表达情况。结果表明，与野生型菌株相比，转化子Sisl2-91和Sisl2—110中Ss-S12的表达水平显著性下降(图3．12)，即Sisl2．91和Sisl2．110菌株为Ss-S12基因沉默转化子，Sisl2．27和Sisl2．50为沉默无效转化子，作为对照。1．41．21O．8O．6O．4O．2O墨辞罨写暑喜秀案嘻蚤萎蒜荡嚣蓑善∞镰磊图3．12不同转化子中$s-S12的表达水平Fig．3．12TheexpressionlevelofSs-S12indifferenttransformants2．6Ss-S12基因沉默转化子的表型2．6．1Ss．S12基因沉默转化子的形态特征如图3．13所示，在PDA上培养15d后观察发现，野生型菌株在菌落边缘产生大量黑色的菌核，而沉默转化子仅形成较大的白色绒毛状菌丝团，在PDA上培养直至30d后这些绒毛状的菌丝团也不会发育成黑色的菌核。通过透射电镜分别对转化子Sisl2．110和野生型菌株的菌核内部超微结构进行观察发现，在野生型菌株形成的菌核中，菌丝与菌丝之间相互紧密粘附，细胞壁加厚且黑化；而在Sisl2．110形成的异常菌核中，菌丝排列疏松，且细胞壁加厚不明显，也没有黑化的现象(图3．14)。冬轿．s协芍oo一蚺曲￡筑×霉o》；露一彤眨 Sisl2．．91Sisl2-110图3．13Sisl2．91和Sisl2．110与野生型菌株的表型比较(20℃，15d)Fi2．3．13PhenotypeofSisl2-110andSisl2—91versusthewildtype(20℃，蕊静醚鲱薄遗辩盏冰蜊Ⅲ∞s-m幅牌僻博嘞 华中农业大学2012届博士研究生学位论文WildtypeSisl2-110图3．14Sisl2。110和野生型菌株形成的菌核内部超微结构观察Fig．3．14UltrastructuralanalysisofsclerotiaproducedbythewildtypestrainandSisl2-1102．6．2Ss—S12基因沉默转化子菌丝生长与致病力对Ss-S12沉默转化子的生长速度进行测定，结果表明Sisl2—110和Sisl2．91的生长速度与野生型菌株没有显著性差异。显微观察沉默转化子菌丝形态后发现其菌丝分支正常，与野生型菌株无差别。对Ss．S12沉默转化子进行番茄和油菜离体叶片致病力测定，结果显示在发病时间与病斑扩展速度上，Ss．S12沉默转化子均与野生型菌株无差别，表明Ss．S12的表达水平与核盘菌的致病力没有关系。2．6．3Ss—S12基因沉默转化子维持细胞完整性能力分析为研究Ss—S12基因沉默对菌丝维持细胞完整性能力的影响，在高渗透条件下分别培养野生型菌株和Ss．S12沉默转化子，结果表明在加入5％NaCl、1．2M蔗糖和1M山梨醇的PDA培养基中，Sisl2．110和Sisl2．91的菌丝生长均比野生型菌株受到更大程度的抑制作用(图3．15)。为进一步研究Ss．S12与核盘菌细胞完整性之间的关系，在添加山梨糖的PDA中分别培养Ss．S12沉默转化子和野生型菌株，结果表明在添加2％和5％山梨糖的PDA中，Sisl2．110和Sisl2．91的菌丝生长与野生型菌株相比受到更强的抑制作用(图3．16A)。在添加5％kh梨糖的PDA中，Sisl2．110在菌丝尖端表现出高频率的细胞质外渗，而在野生型中却只是偶尔观察到此类现象(图3．16B)，以上证据表明Ss—S12沉默转化子在逆境下维持细胞完整性的能力下降，即Ss．S12蛋白与核盘菌维持细胞完整性相关。 ．．堕垄堕堕堕丝盛塑苤重鱼兰皇苎堡塾自l塑窒——，^、零、。一e-善巳a’5％NaCI1．2Msucrose1Msorbitol口Wildtype口Sisl2-91■Sisl2-110图3．15高渗透压对Ss-S12沉默转化子菌丝生长速度的影响Fig．3．15EffectofhyperosmoticpressureonthehyphalgrowthrateofSs-S12silencedstrains4．B2％sorbose5％sorboseWildtype口Wildtype口Sisl2-91■Sisl2．110Sisl2．110图3．16山梨糖对Ss-S12沉默转化子菌丝生长的影响Fig．3．16EffectofL-sorboseonthehyphalgrowthofSs-S12silencedstrains61∞舌；∞加∞∞们∞加竹0一∞cQxc芑co；一Q—cc—O0O0654321一零一c蓦oJb一彤L|cI》c-oco；一cl—cc— 华中农业大学2012届博士研究生学位论文2．7Ss—S12基因沉默转化子中黑色素合成相关基因的表达与野生型菌株相比，Ss—S12沉默转化子只能形成白色的菌丝团，而不能继续发育形成黑色的菌核，推测Ss-S12可能与菌核中的黑色素合成相关，抑制Ss-S12的表达将导致黑色素合成相关基因的表达受到影响，进而导致黑色素合成减少。通过对核盘菌基因组进行BLAST同源比对分析，获得了核盘菌黑色素合成途径中的聚酮合成酶基因Ss-Pksl(SSlG13322，XM001585755)。Ss-Pksl与许多真菌中已报道的聚酮合成酶基因均高度同源，蛋白质保守结构分析表明Ss．Pksl蛋白具有典型的PKSAT(Acyltransferasedomaininpolyketidesynthase)结构域。利用Real—timeRT-PCR技术对Ss-S12沉默转化子中Ss-Pksl基因的表达水平进行分析，结果表明，与野生型菌株相比，Ss—S12沉默转化子中Ss-PksJ基因的表达量显著下降(图3．17)。1．21O．80．6O。40．2OWildlypeSisl2-91Sisl2·110图3．17Ss-S12沉默转化子中Ss-Pksl的表达水平Fig．3．17TheexpressionlevelofSs-PkslinSs-S12silencedstrains3结论与讨论3．1结论核盘菌Ss．S12蛋白全长352aa，具有一个信号肽结构和两个PAN模块，其同源蛋白仅仅出现在部分子囊菌中且均为功能未知蛋白。在核盘菌菌丝生长阶段，少量Ss．S12蛋白分布于细胞壁和隔膜上；在菌核形成阶段，Ss—S12表达量迅速升高，Ss．S12蛋白大量分布于细胞外加厚的细胞壁上。Ss-S12的表达水平受c舢的抑制，而与环境pH无关。Ss—S12基因沉默转化子维持保持细胞完整性的能力受损，但是菌丝生长和致病力与野生型菌株没有差异。Ss—S12基因沉默转化子在菌核发育初期能co一协∞小ra×oo>；毋一。匮 核盘菌茵核形成相关蛋白Ss-S12功能研究形成白色绒毛状菌丝团，但是菌丝团不能黑化和固化形成菌核。在菌丝团内部菌丝排列疏松，细胞壁加厚不明显。$s-S12基因沉默转化子中黑色素合成相关基因Ss-Pksl表达量显著下降。3．2讨论菌核在核盘菌生活史和病害循环中均起着重要的作用，研究菌核的形成机理将为菌核病的防治提供重要的线索。目前为止对核盘菌菌核形成机理的研究还不够深入，且主要集中在一些与菌核形成密切相关的细胞内信号转导途径上(Rollins，2003；Cheneta／．，2004；Juricketa1．，2004；Chen&Dickman，2005；Erentaleta1．，2007；Jurick＆Rollins，2007)，但对作用在这些信号途径下游的一些重要结构蛋白或者酶的功能还不清楚。在本研究中，Ss-S12基因的表达在核盘菌菌丝生长阶段较低，而在菌核形成阶段显著性升高，表明其可能与菌核形成密切相关。Ss-S12基因的表达水平受到cAIV[P水平的负调控，而与环境pH无关。Chen等(2005)研究表明核盘菌中cAMP水平的升高将阻遏Ras．MAPK信号途径的转导，而Ras．MAPK信号途径与菌核形成密切相关，抑制该途径将导致菌核形成受阻。Ss-S12基因的表达受cAMP负调控且在菌核形成阶段表达量迅速升高，推测该基因可能作用在Ras．MAPK途径下游，且与菌核形成密切相关，对其功能进行解析将有助于理解菌核形成的机理。蛋白质结构分析表明Ss．S12含有两个保守的结构域，这两个结构域均与血液凝固因子10(FⅪ)中的PAN模块高度相似。Brown等(2003)研究表明含PAN模块的蛋白存在于多种生物中，如哺乳动物、植物、卵菌、细菌和原生动物，但是在真菌中还未见报道。PAN模块之间的氨基酸相似性较低，一般存在4个保守的半胱氨酸，这4个半胱氨酸组成了两对二硫键。在哺乳动物血液凝固因子lO(FⅪ)、肝细胞生长因子(HGF)等蛋白的PAN模块中还存在第3对二硫键，其连接PAN模块的N端和C端，这种PAN模块又被称为Apple结构域(Browne／a／．，2001)。一般认为PAN模块的功能为介导蛋白质与蛋白质(如FⅪ)或蛋白质与碳水化合物(如HGF)之间的互作(Zhouetal．，1999；Liethaetal．，2001)。许多PAN模块具有碳水化合物结合的能力，如刚地弓形体(Toxoplasmagondii)微线体蛋白MIC4(Brechteta1．，2001)、柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)微线体蛋白EtMIC5(Brownetal．，2003)、寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)CBEL蛋白(Brownetal，2003；Kamouneta1．，2007)等。CBEL蛋白中的PAN模块具有纤维素结合能力。值得注意的是在Ss-S12与CBEL具有相同的亚细胞定位和相似的蛋白结构，它们都位于细胞壁上，且都含有一个信号肽和两个PAN模块。目前为止还不清楚Ss—S12蛋白中的PAN模块是否 华中农业大学2012届博士研究生学位论文具有结合碳水化合物的功能，但是其在菌核形成起始阶段大量聚集于细胞壁外围的纤维层上，推测其可能具有类似的功能。许多含有PAN模块的蛋白起着粘附相关的功能，如EtMIC5(Browneta1．，2003)和CBEL蛋白(Gaulinetal．，2002)等。当抑制CBEL基因的表达时，寄生疫霉对纤维素基质的粘附能力大幅度下降(Gaulineta1．，2002)。在核盘菌菌核形成起始阶段，菌丝与菌丝相互接触形成绒毛状的气生菌丝簇，气生菌丝簇进一步凝聚形成浓缩的菌核原基(Li&Rollins，2009)。由菌丝转变形成浓缩的菌核原基时，核盘菌需要分泌一种粘质物来起着菌丝粘附剂的作用(Erentaleta1．，2008)。目前为止对茵核形成相关的粘附蛋白还不清楚。核盘菌细胞壁蛋白Ss．S12含有两个PAN模块，且在菌核形成起始阶段表达量急剧升高，推测该蛋白可能起着细胞粘附相关的作用。当抑制Ss册的表达时，突变体可以形成白色绒毛状的菌丝簇，但是这些菌丝簇不能进一步形成致密的菌核原基。透射电镜观察表明在这些绒毛状的菌丝簇中菌丝与菌丝之间排列稀疏，而在成熟的菌核中菌丝与菌丝之间紧密相连，间接表明该蛋白可能起着粘附相关的作用。与野生型菌株相比，Ss-S12沉默转化予形成的菌丝团始终无黑色素沉积。黑色素是核盘菌菌核的重要组成部分，其有助于菌核抵抗外界不良的生物或者非生物环境(Boltoneta1．，2006)。黑色素沉积也是核盘菌菌核成熟的标准之一，成熟的菌核一般呈现出致密的黑色。本研究发现Ss．S12蛋白不仅与核盘菌菌丝团凝聚有关，也有可能与菌核黑色素形成相关。与野生型菌株相比，Ss-S12沉默转化子中聚酮合成酶基因Ss-Pksl表达水平显著性下降，这可能是&姚沉默转化子菌核黑色素缺失的原因，推测Ss-S12可能间接调控菌核黑色素合成途径相关基因的表达，但是具体作用机制还有待进一步的研究。 核盘菌菌核形成相关蛋白Ss·S12功能研究第四章Ss．S12蛋白作用机理研究Ss．S12在核盘菌生长发育过程中起着十分重要的作用，抑制Ss-S12基因的表达将导致核盘菌菌核形成异常及维持细胞完整性的能力受损。由于Ss—S12的同源蛋白均被注释为功能未知蛋白，对其生化功能尚不明了，因此对Ss．S12控制菌核形成和维持细胞完整性的的机理仍不清楚。鉴定与研究Ss．S12互作蛋白的功能不仅有助于深入揭示Ss．S12蛋白的作用机理，也有助于理解核盘菌菌核形成及维持细胞完整性的机制。本章将首先通过免疫共沉淀结合酵母双杂交的方法筛选与鉴定Ss．S12的互作蛋白，然后通过RNAi等方法研究互作蛋白在核盘菌生长发育过程中的作用，以初步明确Ss．S12控制菌核形成和维持细胞完整性的机制。1材料与方法1．1材料1．1．1菌株及培养方法Y2HGold作为酵母双杂交宿主菌，来源于Clontech公司，30℃于YPD培养基上培养，于20％甘油中．80℃保存。1．1．2质粒及载体酵母双杂交诱饵蛋白载体pGBKDT7(KanE)，靶蛋白载体pGADT7(血np‘)、阳性对照质粒pGBKDT-53(Kana‘)和pGADT7-T(Amp’)均来源于Clontech公司。pAN7—2(Amp‘)、pSKH(KanE)和pEASY-T1(Amp‘)为本实验室保存；pGXT(Amp。)和pCXSN(Kanar)为湖南农业大学王国梁教授惠赠，以上载体均用于基因沉默载体的构建。 华中农业大学2012届博士研究生学位论文1．1．3酶、培养基及其它试剂XcmI购自NewEnglandBiolabs公司：Western及IP细胞裂解液、ProteinA+Gagarose为碧云天公司产品；酵母完全培养基YPD、YPDA(YPD+Agar)、酵母缺陷性培养基SD／-Trp／-Leu、SD／-Trp／-Leu／-His和SD／-Trp／-Leu／．His／-Ade购自Clontech公司；x—Q—gal和YeastmakerCarderDNA购自Sigma公司。其它常用化学试剂为国产分析纯。1．2方法1．2．1免疫共沉淀将核盘菌野生型菌株Sunf-M于PDA培养基上培养4d后，收集培养物提取总蛋白质，核盘菌总蛋白提取方法据第3章第1．2．7节。取1mg的总蛋白，加入1嵋的免疫前血清和20山充分重悬的ProteinA+GAgrose，4℃缓慢振荡0．5．2h，2500rpm条件下离心5min，取上清，加入2岭的Ss．S12蛋白抗体，4℃缓慢振荡过夜。加入20山充分重悬的ProteinA+GAgrose，4℃缓慢振荡1．3h。2500rpm离心5min，弃上清，沉淀用PBS洗涤5次，加入20．40pl蛋白上样缓冲液悬浮沉淀。样品于100℃水浴处理3．5min后经SDS．PAGE电泳检测。SDS．PAGE电泳方法见第3章第1．2．4节。1．2．2蛋白质LC．MS／MS质谱分析对免疫共沉淀得到的蛋白进行SDS．PAGE电泳，切割整个电泳条带，用胰蛋白酶水解，水解产物冻干后用TEMOnanaLC液相系统进行分离，再用QTRAP3200质谱仪进行串联质谱分析，将质谱分析的结果与核盘菌蛋白质质谱数据库进行比对分析以确定未知蛋白的序列。1．2．3酵母双杂交相关载体的构建以核盘菌cDNA为模板，利用特异性引物BD．S12F和BD．S12R(表4．1)来扩增Ss—S12编码17—352位氨基酸的eDNA序列，两边加上NdeI和SaB酶切位点(见引物划线处)。PCR产物经割胶纯化，NdeI和SalI酶切后，连接至诱饵蛋白载体 核盘茵菌核形成相关蛋白Ss—S12功能研究pGBKTT7(图4．1A)中并转化大肠杆菌JMl09，PCR和酶切鉴定阳性克隆，测序验证读码框的正确与否，阳性克隆命名为pGBKTT7·S12。AB图4．1诱饵蛋白载体pGBKT7(A)和靶蛋白载体pGADT7(B)图谱Fig．4．1MapofbaitvectorpGBKT7(A)andbarvectorpGADT7圆)从LC．MS／MS测序结果中选取部分蛋白，包括3．磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、细胞延伸因子(EF．1a)、沃鲁宁体主要组成蛋白(Hexl)、热击蛋白60(HsP60)、热击蛋白70(HSP70)、热击蛋白90(HSP90)、ATP合成酶beta亚基(ATPB)、肌动蛋白(Actin)、组蛋白H2B、组蛋白H4等，设计特异性引物扩增这些蛋白编码基因的eDNA序列，引物两边加上合适酶切位点(表4．1)。PCR产物经割胶纯化和酶切后，连接至靶蛋白载体pGADT7(图4．1B)中并转化大肠杆菌JMl09，酶切鉴定阳性克隆，测序验证读码框的正确与否，所构建的载体名称见表4．1。1．2．4酵母感受态的制备将酵母菌株Y2HGold于YPDA平板上划线，置于30℃下培养3d。挑取单菌落接种于3IIll的液体YPD培养基中，250rpm振荡培养8．12h。取5山的液体培养物至50IIll的YPDA中振荡培养16．20h，直到OD600达到0．15．0．3。培养物于3000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新置于100ml新鲜的YPD中，继续培养至OD600达0．4．0．5。将培养物分装至50砌的离心管中，3000rpm室温离心5min，去除上清，沉淀用无菌水清洗后悬浮至1．5IIll的1．1xTE／LiAC溶液中。12000rpm离心15S后去除上清，沉淀重新悬浮于600山的1．1xTE／LiAC溶液中，感受态即制备完成。67 华中农业大学2012届博士研究生学位论文表4．1酵母双杂交相关载体构建所用引物!垒垒!曼兰：!!!塾翌竺!!竺璺!空!竺!竺翌!!!竺!!!竺!!!!!!翌羔!苎苎!塑!竺：堑垒盟堡引物引物序列酶切位点载体注：各引物酶切位点见引物下划线处。1．2．5酵母转化方法在EP管中依次加入0．1鹇诱饵蛋白载体、0．1嵋靶蛋白载体、100腭YeastmakerCarderDNA和100山酵母感受态细胞，轻轻混匀。加入500山PEG／LiAC溶液，涡旋混匀，置于30℃下缓慢振荡培养30min。加入20山的DMSO并轻轻混匀，于42℃水浴15min：水浴结束后迅速放至冰上冷却l一2rain。14000rpm离心5s，去除上清，将细胞重新悬浮至0．9％的NaCl中。取100m菌液均匀涂布至合适的SD 核盘菌菌核形成相关蛋白Ss-Si2功能研究平板上，于30℃条件下倒置培养3d，直到酵母菌落长出。1．2．6蛋白质保守结构域分析蛋白同源比对采用BLASTp在线软件(http：／／blast．ncbi．nlm．nih．gov／Blast．cgi)，蛋白保守结构域分析采用在线保守结构分析软件CDD(www．ncbi．nlm．nih．Gov／Structure／cdd／cdd．shtml)和SMART(smart．embl-heidelberg．De／smart／set_mode．cgi?NORMAL=I)(Letuniceta1．，2008；Marchler-Bauereta1．，2011)。1．2．7Ss．Gpd和Ss-Hexl基因沉默载体的构建Ss-Gpd并11Ss-Hexl沉默载体的构建策略参考Nguyen等(2008)，具体步骤如下：用引物PtrpCFP(5’-CGAGCTCGTCGACAGAAGATGACATTG一3’)和PtrpCRP(5’一CCATCGATTATC@盯GCTTGGGTAGAA一3’)从载体pSKH中扩增PtrpC启动子，两边分别加上酶切位点SacI和ClaI，PCR产物回收纯化后用连接酶连至pEASY-T1载体中TA克隆位点，用SacI验证酶切产物连接方向，能切下400bp左右的片段为阳性克隆，将其命名为pEP。用引物PGpdFP(5’-GAGCTCTGAGGTGCAGTGGArGA-3’)和PGpdRP(5’．TCTAGAGGTGATGTCTGCTCAAGCGG-3’)从载体pAN7-2中扩增PGpd启动子，两边分别加上酶切位点HindlII和BamHI，PCR产物回收纯化后用HindlII和BamHI酶切处理，酶切产物用乙醇沉淀、晾干，重新溶于TE，用连接酶将酶切产物连接到用相同酶处理的pEP上，得到pEPG。用引物ccdBFP(5’．ATCGArGCCAATACTTGTATGG-3’)和ccdBRP(5’．CGT工AAGTG盼ATCCCCAATACT-3’)从载体pGXT中扩增ccdB基因，两边分别加上ClaI和BamHI酶切位点，PCR产物回收纯化后连接到载体pEPG，得至UpEGX。用HindlII和XhoI酶切pEGX，回收并纯化包含PtrpC-ccdB-PGpd的片段，将其连接至经相同酶处理的双元载体pCXSN，得到pCXDP。用SacI和XhoI从pSKH中切下HPH基因，将其连至经相同酶切的pCXDP，通过酶切验证的阳性克隆命名为pCXDPH。为构建Ss—Gpd沉默转化子，设计特异性引物SigapdhF(5’一CCAATGTACGT 华中农业大学2012届博士研究生学位论文CATGGGTGTC-3’)和SigapdhR(5’-CGAAGTTCTTGTTGAGGGAGA．3’)扩增Ss-Gpd基因cDNA中538bp的片段，PCR产物回收纯化后连至经XcmI酶切的pCXDPH中，经PCR验证得到的阳性克隆命名pSigpd(图4．2)。图4．2RNAi特异性沉默Ss-Gpd的载体图谱Fig．4．2ThevectormapforRNAispecificallysilencingSs-Gpd为构建Ss-Hexl沉默转化子，设计特异性引物SihexlF(5’．GTTACCATCCCTTGCCACCAC．3’)和SihexlR(5’．GGC(讼TCTCACGACCTCCAT-3’)，扩增Ss-Hexl基因cDNA中465bp的片段，PCR产物回收纯化后连至XcmI酶切的pCXDPH中，经PCR验证获得的阳性克隆命名pSihexl(图4．3)。图4．3RNAi特异性沉默Ss-Hexl的载体图谱Fig．4．3ThevectormapforRNAispecificallysilencingSs-Hexl 核盘菌菌核形成相关蛋白Ss．S12功能研究1．2．8Ss—Gpd,【lSs-Hexl基因沉默转化子的获得利用农杆菌介导的核盘菌菌丝转化方法将质粒pSigapd和pSihexl转入核盘菌野生型菌株Sunf-M中，具体转化方法见第2章第1．2．1节。采用Real-timeRT-PCR方法检测Ss—Gpd和Ss-Hexl在转化子中的表达水平。引物RT-Ss-GpdF(5’一AATATGACTCCACTCACGGTCAAT-3’)和RT-Ss—c-rIdR(5’．CCACCCTTCAAATGTGCCTTA．3’)用来验证pSigad转化子中的Ss．Gpd基因的表达情况；引物RT-Ss．HexlF(5’-ATGAAGAAGCCGGAGCCC-3’)和ImSs—HexlR(5'-GGCTTGGGTTGGCGATG．3’)用来验证pSihexl转化子中的Ss-Hexl基因的表达情况。核盘菌Actin基因作为内参，引物序列见第3章第1．2．9节。Real-timeRT-PCR方法参照第3章第1．2．9节。1．2．10沉默转化子的表型分析沉默转化子的表型分析方法同第3章第1．2．14节至第1．2．18节。2结果与分析2．1Ss．S12互作蛋白的筛选为了筛选与Ss．S12互作的蛋白，利用Ss．S12蛋白抗体对核盘菌野生型菌株Sunf-M的总蛋白裂解液进行免疫共沉淀。对免疫共沉淀产物进行串联质谱分析，将质谱分析的结果与核盘菌蛋白质组数据库进行比对分析，发现有19个蛋白在两次独立的实验中均存在(表4．2)。7l 华中农业大学2012届博士研究生学位论文表4．2核盘菌总蛋白Ss．SD抗体免疫共沉淀产物质谱分析Table4．2LC··MS／MSanalysistheCO··IPresultsofS．sclerotiorumtotalproteinswithSs—S12-antibodies8该蛋白的多肽链在2次实验中共检测到的次数。6该蛋白所检测到的多肽链氨基酸数占该蛋白总氨基酸数的百分比。2．2Ss．S12互作蛋白的验证为验证通过免疫共沉淀所得蛋白与Ss．S12之间的互作关系，通过酵母双杂交系统对其中部分蛋白与Ss．S12的直接互作进行了研究。如图4．4所示，pGBKT7一S12分别与pGADT—GAPDH、pGADT．Hexl及pGADT-EF．1a共转化得到的酵母菌株能在SD／-Trp／-Leu／-His／-Ade上正常生长，同时也能在添加X．a．Gal的SD／-Trp／-Leu／-His／-Ade培养基上出现颜色反应。其中pGBKT7-S12与pGADT．GAPDH、pGADT．Hexl共同转化得到的菌株在SD／-Trp／-Leu／-His／．Ade培养基上长势较好，而与pGADT．EF．1et共同转化得到的菌株长势较弱。pGADT．EF．10t与 核盘菌菌核形成相关蛋白Ss-S12功能研究pGADT7共转化及pGADT．GAPDH、pGADT—HexI、pGADT-EF-la分别与pGBKDT共转化得到的菌株既不能在SD／．Trp／-Leu／-His／．Ade培养基上生长，也不能在添加X．Gc．Gal的SD／．Trp／-Leu／-His／-Ade培养基上出现颜色反应；pGBKT7-53与pGADT7．T共转化的菌株做为阳性对照。结果表明Ss—S12与GAPDH、Hexl和EF—la均可发生直接相互作用，其中与GAPDH、Hexl互作较强，而与EF．1c【互作稍弱。pGBKT7pGADT753TSs．S12GAPDHSs．S12GAPDHEF．1ⅡSs-S12EF．1QHexlSs．S12Hexl．Leu—Trp-Leu—Trp．His．AdeX．Q．Gal孽，醚爱辎C冀翌蔓塞r蔓憩，S雪西篁筝窜S}r蹿刍毒崮—釜鲁迄晦{p-；，·．‘窿≥畴两嗣晦瞄I●—————，-’。'——■—-●■—-_---一曼!!!!!!l图4．4GAPDH、EF-la和Hexl与Ss．S12蛋自在酵母细胞中的互作Fig．4．4TheinteractionbetweenSs-S12andGAPDH，EF-1a，Hexlrespectivelyinyeastcells2．3Ss．S12互作蛋白在Ss-S12沉默转化子中的表达分析免疫共沉淀和酵母双杂交试验表明核盘菌甘油醛．3．磷酸脱氢酶(GAPDH，XP001591173．1)及沃鲁宁体主要蛋白(Hexl，XP001595438．1)与Ss．S12发生直接的相互作用，为分析它们之间在基因表达水平上的互作，分别于Genbank上获得了核盘菌GAPDH的编码基因Ss一印d(SSlG07798，XM001591123．1)和Hexl的编码基因Ss-Hexl(SSlG03527，XM001595388．1)。通过Real．timeRT-PCR检测其在Ss—S12沉默转化子中的表达，结果表明Ss．Gpa和Ss-Hexl在Ss．S12沉默转化子中的表达水平与野生型菌株无显著差别。 华中农业大学2012届博士研究生学位论文2．4核盘菌GAPDH蛋白结构分析酵母双杂交显示Ss．512能与GAPDH发生直接的相互作用。GAPDH能催化3一磷酸甘油醛脱氢形成1，3．二磷酸甘油，在细胞内糖酵解过程中起着重要的作用。近年来，越来越多的研究发现除在细胞内参与糖酵解外，GAPDH也出现在细胞表面，起着粘附相关的功能(Gozalboeta1．，1998；Barbosaeta1．，2006；Egeaeta1．，2007；Mattaeta1．，2010)。由于Ss．S12定位于细胞表面，推测在核盘菌中也有部分GAPDH蛋白位于细胞表面并起着类似的功能。核盘菌GAPDH蛋白全长338aa，具有GAPDH蛋白家族的2个功能结构域：NAD+结合区和郇dhC结构域(图4．5)。在NCBI数据库上进行BLASTp比对发现该蛋白与灰霉菌(曰．fucke厅ana)、金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisop，fae)、黄绿绿僵菌(Macridum)、粗糙脉胞菌(Ⅳcrassa)等中的GAPDH蛋白均高度同源，其中与灰霉菌的GAPDH蛋白同源性最高，二者氨基酸一致性达97％(E值为0)。图4．5核盘菌GAPDH蛋白结构Fig．4．5ProteinstructureofGAPDHin&sclerofiorum2．5Ss—Gpd基因沉默转化子的获得为研究GAPDH在核盘菌生长发育过程的作用，构建了核盘菌GAPDH的编码基因Ss—Gpd的沉默载体pSigpd。如图4．2所示，Ss．Gpd基因cDNA的部分序列同时被置于ptrpC启动子和Pgpd启动子的控制下，构成了一个典型的RNAJ结构。将pSigpd通过农杆菌介导转化方法导入到核盘菌野生型菌株Sunf-M中，通过Real-timeRT-PCR方法对部分转化子中的Ss—Gpd基因的表达水平进行检测，结果表明在转化子Sigapdh一27和Sigapdh．53中Ss．Gpd基因的表达水平与野生型菌株相比出现不同程度的下降(图4．6)，即Sigapdh．27和Sigapdh．53菌株为Ss．apd沉默转化子，而Sigapdh．3为沉默无效转化子，用作对照。74 §要至耋n鼍高鼍器a垡．璺丽∞图4．6Ss-Gpd在pSigpd转化子中的表达水平Fig．4．6ThemRNAlevelofSs-GpdindifferentisolatescontainingpSigpd2．6Ss一印刀基因沉默转化子中Ss—S／2的表达情况免疫共沉淀和酵母双杂交结果表明Ss．S12与GAPDH在蛋白水平上相互作用，为研究Ss—GpdSs—S12在基因水平的互作情况，通过Real—timeRT-PCR检测Ss—apd沉默转化子中曲册基因的表达水平。结果显示，与野生型菌株相比，Ss一@d沉默转化子中Ss—S／2的表达水平出现显著下降(图4．7)。星0．2O毫卜!昌Ni丽上_旨箔矗∞图4．7Ss-S12在Ss-Gpd沉默转化子中的表达水平Fig．4．7ThemRNAlevelof$s-S12inSs-Gpdsilencedstrains2．7Ss．唧d基因沉默转化子的表型分析如图4．8所示，在PDA培养基上培养15d之后，野生型菌株Sunf-M在菌落边75421悬怎42OLtO口Iao．s∞-ocO一西西9-A×oo>一苗一mI比42，蠢屉^LtO魁∞．s们-Oco一∞西￡△×oo>譬西 缘形成黑色坚硬的菌核，而Sigapdh．27和Sigapdh．53菌株仅仅形成绒毛状菌丝团，继续培养30d后，绒毛状菌丝团也不会变成黑色的菌核，其表型与Ss-S12沉默转化子较为相似。WildtypeSigapdh．3Sigapdh-27Sigapdh．53图4．8Sigapdh-27和Sigapdh．53与野生型菌株形态比较(20℃，15d)Fig·4．8PhenotypeofSigapdh-27andSigapdh一53versusthewildtypestrain(20℃，15d)2．8核盘菌Hexl蛋白结构分析除GAPDH之外，免疫共沉淀和酵母双杂交试验也表明核盘菌沃鲁宁体主要组成蛋白Hexl与Ss—S12直接相互作用。HexI蛋白是子囊菌特有细胞器沃鲁宁体的主要组成蛋白，其在维持细胞完整性中起着重要的作用(Trincietal一1974；Tenneyef口，．，2000；Jedd&Chua，2000；Momanyeta1．，2002；Soundararajaneta1．，2004；Dhavale&76 核盘菌菌核形成相关蛋白ss．S12功能研究Jedd．2007)。核盘菌Hexl蛋白全长166aa，在C端具有S1一Hexl结构域(图4．9)。在NCBI数据库上进行同源性比对表明其与灰霉菌(B．fuckeliana)、粗糙脉胞菌(Ⅳc阳船以)和深绿木霉(Trichodermaatroviride)等中的Hexl蛋白均高度相似，其中与灰霉中的Hexl蛋白同源性最高，二：者的氨基酸序列一致性达到99％(E值为2e．93)。150100150166图4．9核盘菌Hexl蛋白结构Fig．4．9ProteinstructureofHexlin＆sclerotiorum2．9Ss-Hexl基因沉默转化子的获得为研究Hexl在核盘菌生长发育过程的作用，构建了其编码基因Ss-Hexl的沉默载体pSihexl。如图4．3所示，Ss．Hexl基因cDNA的部分序列同时被置于P印C启动子和Pgpd启动子的控制下，构成了一个典型的I斟加结构。将pSihexl通过农杆菌介导转化方法导入到核盘菌野生型菌株Sunf_M中，通过Real．timeRT-PCR方法对部分转化子中的Ss—HexI基因的表达水平进行检测，结果表明在转化子Sihexl．1和Sihexl．10中，Ss．Hexl基因的表达水平与野生型相比出现不同程度的下降(图4．10)，即Sihexl．1和Sihexl．10为Ss-Hexl沉默转化子，而Sihex．4为沉默无效转化子，用作对照。罟'兰夏!。r-≥‘，’图4．10Ss-Hexl在不同的pSihexl转化子中的表达水平Fig．4．10TheexpressionlevelofSs-HexlindifferentisolatescontainingpSihexl4218642010rxoZ．∞∽-OcO一价田o．I△×oo>；母一m叱 华中农业大学2012届博士研究生学位论文2．10Ss-Hexl基因沉默转化子中Ss—S12的表达情况免疫共沉淀和酵母双杂交结果表明Ss．S12与Hexl在蛋白水平上相互作用，为研究SsoHexl和Ss．S12在基因水平的互作情况，通过Real．timeRT-PCR检测Ss-ttexl沉默转化子中Ss．S12基因的表达情况。结果显示，与野生型菌株相比，Ss-Hexl沉默转化子中Ss．S12的表达水平出现下降(图4．11)。&参曼善图4．11Ss-S12在Ss-Hexl沉默转化子中的表达水平Fig．4．11TheexpressionlevelofSs-S12inSs-Hexlsilencedstrains2．11Ss-Itexl基因沉默转化子的表型分析2．11．1Ss-Hexl基因沉默转化子菌落形态分别将野生型菌株和Ss-Itexl沉默转化子于PDA上培养15d后发现，野生型菌株在菌核边缘形成均匀分布的菌核，而Ss-Itexl沉默转化子Sihexl．1和Sihexl．10形成的菌核较少，且在培养基中分布不均匀(图4．12)。42，8642O1ON一∞．研们峰oco一协协m‘A×o心>眷再一O比 核盘菌菌核形成相关蛋白ss-s12功能研究WildtypeSihexl-4Sihexl．10图4．12Sihexl和Sihexl与野生型菌株菌落形态比较(20℃，15d)Fig．4．12PhenotypeofSihexl一1andSihexl一10versusthewildtypestrain(20℃，15d)2．11．2Ss-Hexl基因沉默转化子维持细胞完整性能力分析作为沃鲁宁体的主要组成部分，Hexl在维持细胞完整性中起着重要的作用。在稻瘟菌和粗糙脉胞菌中，HexI基因缺失突变体在添加山梨糖的培养基上生长缓慢且在菌丝尖端出现原生质体渗透的现象，即细胞保持完整性能力下降(Tenneyeta1．，2000；Soundararajaneta1．，2004)。为研究该蛋白在核盘菌中的作用，在添加山梨糖的培养基中分别培养Ss．HexI沉默转化子与野生型菌株，并测定它们的生长速度。结果显示，当加入2％和5％的山梨糖时，Sihexl．1和Sihex．10的菌丝生长速度与野生 华中农业大学2012届博士研究生学位论文型相比受到更强的抑制作用(图4．13)。显微观察表明在添加5％山梨糖的培养基中，Sihexl．10的菌丝分支比野生型菌株更加异常(图4．14)。为进一步研究Sihexl．1和Sihex．10的细胞完整性情况，分别于高渗透压条件下培养Sihexl．1、Sihex．10及野生型菌株。结果表明在加入1．2M蔗糖和1M山梨醇的培养基中，Sihexl．1和Sihex．10的生长速度与野生型相比均受到更大的抑制作用(图4．15)。以上证据表明Ss-Hexl沉默转化子在逆境下维持细胞完整性能力受损，即核盘菌Hexl蛋白与维持细胞完整性相关。，．、零、-一[吾2o’2％sorbose5％sorbose图4．13山梨糖对Ss-Hexl沉默转化子菌丝生长速度的影响Fig．4．13EffectofsorbosetothehyphalgrowthrateofSs-HexlsilencedstrainsWildtypeSihexl-10PDAPDA+5％sorbose图4．14山梨糖对Ss-Hexl沉默转化子菌丝形态的影响Fig．4．14EffectofsorbosetothehyphalmorphologyofSs-Hexlsilencedstrains800O0O07654321一仍cQ>L|‰o仁o；一cl—cc— 核盘菌菌核形成相关蛋白Ss-S12功能硬壁壅100孓80=60g弓40L西20O1．2Msucrose1MsorbitolaWildtypeaSihexl-1■Sihexl-10图4．15高渗透压对Ss-Hexl沉默转化子菌丝生长速度的影响Fig．4．15EffectofhyperosmoticpressuretothehyphalgrowthrateofSs-Hexlsilencedstrains3结论与讨论3．1结论利用Ss．S12抗体对核盘菌总蛋白进行免疫共沉淀，产物经质谱分析得到一些蛋白，包括3．磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、细胞延伸因子(EF—la)、沃鲁宁体主要组成蛋白(Hexl)、热击蛋白60(HSP60)、热击蛋白70(HSP70)、热击蛋白90(HSP90)、ATP合成酶beta亚基(ATPB)、肌动蛋白(Actin)、组蛋白H2B、组蛋白H4等，它们与Ss．S12之间可能有着直接或者间接的互作关系。酵母双杂交结果显示Ss-S12与GAPDH、Hexl发生较强的直接相互作用，同时还与EF一10L发生较弱的互作。通过RNAi分别对核盘菌GAPDH和Hexl蛋白的编码基因Ss．Gpa和Ss—Hexl进行了沉默，结果表明：当Ss—q耐基因被沉默后，转化子不能形成正常的菌核，而仅仅在菌落边缘形成绒毛状菌丝团，与Ss-S12沉默转化子菌落形态相似i当Ss．HexI基因被沉默后，转化子菌丝的生长对高渗透压条件和山梨糖更加敏感，表明其维持细胞完整性的能力受到影响，同时转化子形成菌核数量减少且分布不均匀。3．2讨论Ss．S12在核盘菌菌核发育和维持细胞完整性中均起着重要的作用，但是对于其作用机制仍不清楚，筛选与鉴定Ss．S12互作蛋白的功能将有助于理解该机制。免疫共沉淀是研究蛋白与蛋白互作的重要方法之一，该方法不仅可以验证两个蛋白之间的相互作用，也可以筛选与已知蛋白互作的未知蛋白。本研究利用Ss—S12蛋白的抗一母cclxc¨oco—llcI—cc— 华中农业大学2012届博士研究生学位论文体对核盘菌总蛋白进行免疫共沉淀，免疫共沉淀结果经质谱分析后获得了一些蛋白。Ss-S12可能通过与这些蛋白发生直接或间接的互作来发挥其在菌核发育和维持细胞完整性中的作用。在这些蛋白中有一些为核糖体蛋白，核糖体蛋白与核糖核酸相互结合组成核糖体，核糖体与蛋白质的合成相关，推测这些核糖体蛋白的出现可能是由于其在合成Ss-S12的过程中被Ss．S12抗体一起沉淀出来。酵母双杂交实验表明在除核糖体蛋白之外的其他蛋白中GAPDH、Hexl和EF．1a均可以与Ss．S12发生直接的相互作用，推测这3个蛋白可能参与到Ss．S12控制菌核形成和维持细胞完整性的作用中，对这3个蛋白在核盘菌中的功能进行研究可能会初步揭示Ss．S12调控核盘菌菌核形成的作用机制。GAPDH能催化3．磷酸甘油醛脱氢形成1，3．二磷酸甘油，其在细胞内糖酵解过程中发挥着重要的作用。越来越多的研究发现，除在细胞内参与糖酵解外，GAPDH的功能随着其在细胞内定位的不同而有所不同。在一些病原微生物中，如巴西芽生菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、生殖道支原体(Mycoplasmagenitalium)、炭疽杆菌(Bacillusanthracis)tfl大肠杆菌等，部分GAPDH位于细胞壁中并作为一种粘附素(adhesin)起作用，其能结合寄主细胞的纤连蛋白、胶原蛋白和层粘蛋白，从而介导病原菌与寄主细胞的粘附(Gozalboeta1．，1998；Barbosaeta1．，2006；Egeaeta1．，2007；Mattaeta1．，2010)。在马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)中，GAPDH位于细胞壁中且与酵母的凝絮相关(Almeida甜a／．，2003)。将编码GAPDH的基因GAPl转入非絮凝型酿酒酵母菌株中，非絮凝型菌株将会出现絮凝现象(Moreiraeta1．，2000)。这些证据表明，在细胞表面GAPDH可能起着介导细胞与细胞之间的粘附作用。与GAPDH一样，许多生物中的EF．10E(原核细胞中为EF．T“)蛋白除在细胞核内起着转录相关作用之外，也经常出现在细胞表面并在细胞粘附过程中起着重要的作用，如烟草(Zhu&Hasegawaai，1994)、肺炎支原体(Mycoplasmapneumonia)(Dalloetal．，2002)矛I约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)(Granatoeta1．，2004)等。在本研究中，酵母双杂交和免疫共沉淀均表明核盘菌细胞壁蛋白Ss．S12与GAPDH和EF．10【可以发生直接的相互作用。将Ss—Gpd基因沉默后发现核盘菌仅能形成绒毛状菌丝团，不能形成成熟的菌核，该表型与Ss-S12沉默转化子的表型较为相似，表明在核盘菌菌核形成过程中Ss．S12与GAPDH蛋白的互作至关重要，而这种互作可能与核盘菌菌丝细胞之间的粘附相关。除GAPDH外，Ss．S12与Hexl在核盘菌细胞内发生直接的互作。Hexl是沃鲁宁体最主要的组成蛋白。沃鲁宁体是丝状子囊真菌中重要的细胞器，具致密的六面体外形，位于菌丝细胞隔膜的两侧；在细胞受到损伤的时候，沃鲁宁体堵住膜孔， 核盘茵茵核形成相关蛋白Ss．S12功能研究以防止细胞质外渗，因此其在保持细胞完整性中起着十分重要的作用(Trinci&Collinge，1974；Markham&Collinge，1987；Dhavale&Jedd，2007)。在粗糙脉胞菌中，Hexl缺失突变体细胞内沃鲁宁体消失，同时细胞在受到损伤的时候渗漏出大量的细胞质(Jedd&Chua,2000)。在稻瘟菌和粗糙脉胞菌中，Hcxl基因缺失突变体与野生型相比对山梨糖更加敏感(Tenneyeta1．，2000；Soundararajaneta1．，2004)。在本研究中，核盘菌Ss-Hexl沉默转化子同样对山梨糖更加敏感，表明Hexl在维持核盘菌菌丝细胞完整性中发挥重要的作用。推测核盘菌Ss．S12可能通过与Hexl的互作来维持细胞完整性，Ss．S12蛋白的缺失将影响Hexl的功能。当细胞受到损伤的时候，外渗的细胞质驱使沃鲁宁体占据细胞隔膜中的膜孔，从而阻止细胞质的进一步渗漏(Markham&Collinge，1987)。与此同时，在沃鲁宁体和隔膜形成的复合体上形成新的细胞壁，使得受伤的细胞结构得以修复(Trinci&Collinge，1974)。到目前为止，与沃鲁宁体相关的细胞修复机制仍不清楚(Dhavale&Jedd，2007)。筛选和鉴定与沃鲁宁体互作的蛋白将有助于深入揭示该机制。核盘菌Ss．S12定位于细胞隔膜上，同时又与Hexl直接互作，因此推测Ss．S12可能参与到此修复过程中，其可能促进了沃鲁宁体与隔膜的相互结合，但是还需要更多的证据。Ss．S12与GAPDH和Hexl之间的互作不仅发生在蛋白水平，还可能发生在基因水平。本研究表明，与野生型菌株相比，在Ss-Gpd和Ss-Hexl沉默转化子中Ss-S12基因的表达水平出现不同程度的下降，而在Ss—S12沉默转化子中Ss—Gpd和Ss-Hexl的表达水平却没有变化。推测Ss-Gpd和Ss-Hexl可能作用在Ss-S12上游，而且具有直接或间接诱导Ss-S12表达的功能，但对其机制还不清楚。 华中农业大学2012届博士研究生学位论文第五章结论与展望许多丝状真菌均可形成菌核，其中包括一些重要的植物病原真菌如核盘菌、灰霉菌、水稻纹枯病菌、大丽轮枝菌、麦角菌等，菌核是它们越冬、越夏和繁殖的重要组织，也是由其所引起的植物病害侵染循环的重要环节。深入研究菌核形成的分子机制对于理解真菌的生长发育机理和防治植物病害均具有十分重要的意义。目前为止，对核盘菌菌核形成的分子机制研究还很少，绝大部分研究均集中于菌核的形态、生理以及影响菌核形成和萌发的环境因素上。其中一个重要原因是核盘菌遗传转化方法比较复杂，对其开展基因功能相关研究较为困难。因此，本研究以核盘菌作为对象，首先对建立其简便稳定的遗传转化体系进行了探索。此外，为深入研究核盘菌菌核形成机理，本实验室前期利用Illumina-Solexa技术对核盘菌菌丝生长和菌核形成过程中的基因表达水平作了比较，发现其中一个基因Ss-S12在菌核形成阶段表达量大约上升了400倍，推测该基因可能在菌核形成过程中起着十分重要的作用。基于此，本研究采用RNAi、免疫胶体金、免疫共沉淀、酵母双杂交等分子生物学的方法对该基因在菌核形成中的作用以及机理进行了探索，并得到了以下的结论：(1)以核盘菌的菌丝作为受体，建立了农杆菌介导的核盘菌转化体系。该体系操作简便，转化效率较稳定，为开展核盘菌生长发育及致病相关功能的研究提供了良好的平台。(2)本研究发现潮霉素磷酸转移酶基因在核盘菌转化子无性阶段能稳定遗传，但是在其有性后代中出现丢失。(3)核盘菌Ss．S12蛋白全长352aa，具有一个信号肽结构和两个PAN模块，其同源蛋白仅仅出现在部分子囊菌中且均为功能未知蛋白。(4)在核盘菌菌丝生长阶段，少量Ss．S12蛋白分布于细胞壁和隔膜上；在菌核形成阶段，Ss-S12表达量迅速升高，Ss．S12蛋白大量分布于细胞外加厚的细胞壁上。Ss-S12的表达水平受cAMP水平的抑制，而与环境pH无关。Ss-S12基因沉默转化子维持细胞完整性的能力下降，但是菌丝生长和致病力与野生型菌株没有差异。Ss．S12沉默转化子在菌核形成初期能形成白色绒毛状菌丝团，但是绒毛团不能固化和黑化而发育形成成熟的菌核。菌丝团内部菌丝排列疏松，细胞壁加厚不明显。 核盘菌菌核形成相关蛋白Ss-S12功篮巫窒(5)Ss-S12与3．磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)互作，在核盘菌茵核形成过程中起着重要作用；Ss．S12还与沃鲁宁体主要组成蛋白Hexl互作，在维持菌丝细胞完整性中发挥着重要作用。综上所述，本研究初步建立了简便稳定的农杆菌介导的核盘菌菌丝遗传转化体系，并在此体系的基础上对菌核形成相关蛋白Ss．S12的作用及其机理进行了研究，取得了一些结果，为深入揭示菌核的形成机理提供了理论依据，也为菌核病的防治提供的重要线索。纵观整个研究，在一些方面仍不完善，有待于进一步的探索，未来可从以下方面进行着手：(1)与其它真菌的遗传转化体系相比，尤其是以分生孢子作为转化受体的真菌如稻瘟菌、灰霉菌等，本研究建立的农杆菌介导的核盘菌菌丝转化体系的转率仍然较低，难以满足建立大规模突变体库的要求，因此需要对此体系的各种转化条件进行优化，如共培养的时间，共培养时农杆菌的浓度、AS的浓度、核盘菌菌丝的生长状况等，以进一步提高转化效率。(2)由于技术局限等原因，本研究仅通过RNAi等方法解析了Ss．S12蛋白的生物学功能，推测该蛋白可能在菌核形成过程中起着细胞粘附相关的作用，但是缺乏强有力的生化证据。下一步可通过蛋白纯化、酶活等相关实验对Ss．S12蛋白的具体生化功能进行研究以深入解析其控制菌核形成的机理。(3)本研究通过免疫共沉淀和酵母双杂交等技术发现Ss-S12可与GAPDH、EF．1a蛋白发生直接的相互作用，由于Ss．S12定位于细胞壁中，推测这种互作可能发生在核盘菌菌丝的细胞表面，但是缺乏直接的实验证据。下一步可通过双分子荧光互补等技术对Ss．S12与GAPDH、EF．1Q等蛋白在细胞中的互作区域进行深入的研究，以进一步明确Ss．S12蛋白的作用机理。(4)本研究表明Ss．S12与Hexl蛋白可发生直接的相互作用，推测Ss-S12蛋白可能通过沃鲁宁体来发挥其在维持细胞完整性中的作用，但是对于它们之间具体的作用机制还不清楚，有待于进一步的研究。(5)越来越多的证据表明田间的核盘菌菌株已产生抗药性，开发新型安全的药剂防治菌核病迫在眉睫。本研究表明Ss—S12定位于核盘菌菌丝细胞壁上且与菌核形成密切相关，其可能为开发新型化学药剂防治菌核病提供一个潜在的作用靶标。(6)本研究表明Ss．S12在核盘菌菌核形成过程中起着重要的作用，Ss-S12不仅 ———————————————望主奎些盔堂垫!兰旦蔓主堕塞生堂垡迨窒出现在核盘菌中，其同源蛋白也出现在灰霉菌中，下一步可通过基因敲除等方法对其同源蛋白在灰霉菌中的功能进行研究，以揭示该蛋白普遍的生物学意义，并深入理解菌核的形成机制。 ．．一．垫垄堕堕堇垄盛塑苤至自墨!：兰!三垫篮塑壅一●____--_。____-_____---●____●_______●●_-_____l●___l____I_______l-lI_●●__。。__-。。。-_--。。。。。。’———。。’———————————————————一一一参考文献1．傅廷栋．杂交油菜的育种与应用．武汉：湖北科技出版社，1995．2．宫晓艳．盾壳霉T-DNA插入体库的构建及两个分生孢子形成相关基因的克隆．【博士学位论文】．武汉：华中农业大学图书馆，2007．3．江明．农杆菌介导核盘菌菌丝转化体系的建立及SsDRV下调基因Ss—CYPI的功能初步研究．[硕士学位论文】．武汉：华中农业大学图书馆，2007．4．康振生．植物病原真菌的超微结构．北京：中国科学技术出版社，1995，8．5．王道本译．核盘菌论丛．北京：农业大学出版，1986，l一20．6．杨新美．油菜茵核病在我国的寄主范围及生态特性的调查研究．植物病理学，1959，15：111-121．7．张成省，李多川，孔凡玉．真菌茵丝细胞壁可溶性蛋白提取方法研究．山东科学，2004，17：】2．16．8．AdamsPB，AyersWA．EcologyofSclerotiniaspecies．Phytopathology，1979，69：896．898．9．AkamatsuH，ItohY，KodamaM，OtaniH，KohmotoK．AAL-toxin—deficientmutantsofAlternariaalternatatomatopathotypebyrestrictionenzyme-mediatedintegration．Phytopathology，1997，87：967-972．10．AlmeidaC，QueirtsO，WhealsA，TeixeiraJ，Moradas-FerreiraP．AcquisitionofflocculationphenotypebyKluyveromycesmarxianuswhenoverexpressingGAP1geneencodingallisoformofglyceraldehyde一3-phosphatedehydrogenase．JMicrobiolMeth，2003，55：433—440．11．AlvarzRA，BlaylockMW，BasemanJB．Surfacelocalizedglyceraldehyde一3-phosphatedehydrogenaseofMycoplasmagenitaliumbindsmucin．MolMicrobiol，2003，48：1417-1425．12．ArahanaVS，GraefGL，Specht厄，SteadmanJR,EskridgeKM．IdentificationofQTLsforresistancetoSclerotiniasclerotioruminsoybean．CropSci，2001，’41：180．188．13．AronhemA，ZandiE，HennemannH，ElledgeSJ，KarinM．IsolationofallAP一1repressorbyanovelmethodfordetectingprotein-proteininteractions．MolCellBiol，1997，17：3094-3102．14．AuerbachD，FetchkoM，StagljarL．Proteomicapproachesforgeneratingcomprehensiveproteininteractionmaps．DrugDiscovToday，2003，2：85-92．15．BaileyKL，JohnstonAM，KutcherHR,GossenBD，Morrall＆认．Managingcroplossesfromfoliardiseaseswimfungicides，rotation，andtillageintheSaskatchewanParklandspringsownoilseedrape．CropProt,2000，17：405-41I．87 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一垫垄堕堕垫避塑塑鱼璺兰兰!!．垫堂塑窒_______-___-。______l-__--__。-___-●__-●_-____-___I___●__-I_-_-_-_-_-____l__-—。。。’————————————————一。——sclerotiorumencodelectins、Ⅳi廿ldistinctyetcompensatoryregulation．FungGenetBiol，2010，47：531—538．113．LiRR．imnlerRBuchwaldtL，SharpeAG'Senguin-SwartzG，HegedusDD．InteractionofSc彪rotiniasclerotiorumwithBrassicanapus：cloningandcharacterizationofendo—andexopolygalacturonasesexpressedduringsaprophyticandparasiticmodes．FungalGenet’2004，41：754-765．14．LiethaD，ChigadzeDYMulloyB，BlundellTL，GherardiE．CrystalstructuresofNKl．heparincomplexesrevealthebasisforNKlactivityandenableengineeringofpotentagonistsoftheMETreceptor．EMBOJ，2001，20：5543-5555．15．Lirmemannst6nsP，VossT，HeddenP，GaskinP，TudzynskiB．DeletionsinthegibberellinbiosynthesisgeneclusterofGibberellafufikuroibyrestrictionenzyme．mediatedintegrationandconventionaltransformation-mediatedmutagenesis．ApplEnvironMicrobiol，1999，65：2558—2564．16．LiuH，CottrellTR,PieriniLM，GoldmanWE，DoeringTL．RNAinterferenceinthepathogenicfungusCryptococcusneoformans．Genetics，2002，160：463-470．17．LiuH，GuoX，NaeemMS，LiuD，XuL，ZhangW，TangG，ZhouW．TransgenicBrassicanapusL．1inescarryingatwogenecontructdemonstrateenhancedresistanceagainstPlutellaxylostellaandSclerotiniasclerotiorum．PlantCellTissOrg，2011，106：143—151．18．LuS，LyngholmL，YangG，BronsonC，YoderOC，TurgeonBG．TaggedmutationsattheToxllocusofCochliobolusheterostrophusbyrestrictionenzyme—mediatedintegration．ProcNatlAcadSciUSA，1994，91：12649·12653．19．LumsdenRD，DowRL．HistopathologyofSclerotiniasclerotioruminfectionofbean．Phytopathology，1973，63：708-715．120．LumsdenRD．Sclerotiniasclerotioruminfectionofbeanandtheproductionofcellulose．Phytopathology，1969，59：653-657．121．MagroP，MarcianoP，DiLennaP．OxalicacidproductionanditsroleinpathogenesisofSclerotiniasclerotiorum．FEMSLett,1984，24：9-12．122．ManivasakamP，AubrechtJ，SidhomS，SchiestlRH．RestrictionenzymesincreaseefficienciesofillegitimateDNAintegrationbutdecreasehomologousintegrationinmammaliancells．NucleicAcidsRes，2001，29：4826-4833．123．MaorRPuyeskyM，HorwitzBA，SharonA．Useofgreenfluorescentprotein(GFP)forstudyingdevelopmentandfungal-plantinteractioninCochliobolusheterostrophus．MycolRes，1998，102：491-496．124．Marchler-BauerA，LuS，AndersonJB，ChitsazF，DerbyshireMK,DeWeese·ScottC，FongJI-I，GeerLV,GeerRC，GonzalesNR,GwadzM，HurwitzDI，JacksonJD，KeZ，LanczyckiCJ，LuF，MarchlerGH，MullokandovM，OmelchenkoMVRobertsonCL，SongJS，ThankiN，YamashitaRA，ZhangD，ZhangN，ZhengC，BryantSH．CDD：aconserveddomaindatabaseforthefunctionalannotationofproteins．95 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华中农业大学2012届博士研究生学位论文致谢本论文之所以能付梓成册，与导师姜道宏教授的悉心指导是分不开的。从论文的规划、设计、实施乃至撰写和修改，无不凝聚了导师大量的精力与心血。在六年的研究生阶段，导师在生活、学习和科研等各方面都给予了我无微不至的关怀和照顾。导师渊博的知识、深邃的思想和敏锐的视角给我了很多的启示；导师豁达的处事方式和坚韧的意志品质深深感染着我，教会我顽强向前，永不放弃!值此论文完成之际，谨向导师致以我最由衷的敬意和最诚挚的祝福!深深的感谢付艳苹副教授。六年来，付老师在学习和生活上都给了我无尽的爱护，也为论文的实施、撰写和修改倾注了心血和智慧。付老师严谨的科学态度、敏捷的科研思路和乐观的生活理念让我终身铭记!感谢本课题组程家森副教授、谢甲涛副教授给我提供了许多宝贵的意见和建议，感谢他们在我生活上给予的照顾和帮助。感谢李国庆教授和黄俊斌教授在我研究生期间给予的指导、鼓励和关怀；感谢侯明生教授、董五辈教授、洪霓教授、肖炎农教授、罗朝喜教授给我的热心指点和无私帮助；感谢西北农林科技大学康振生教授和韩青梅副教授在实验中给予的指导；感谢加拿大Guelph大学TomHsiang教授在论文修改过程中给予的帮助：感谢院办许智勇老师和研究生院冉鸿昌老师在我研究生期间给予的热情帮助；感谢植物科技学院所有的领导和老师十年来对我的教育和培养!本实验室的兄弟姐妹们在我平时的学习和生活中给予了无私的帮助和指导，他们的陪伴也使我的研究生生活增添了许多快乐，在此向他们表示深深的谢意，他们分别是：江明、曾凡云、张丽艳、Hamid、邓清超、李博、朱闻君、羊国根、刘慧泉、王婧、唐清、肖雪琼、孙西平、魏玮、王明红、于晓、吕学良、刘荣等；本科同学李其利、杨帆、宋波在研究生学习和生活中都曾给我许多支持和帮助，在此一并表示谢意。感谢湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室提供的良好实验条件。感谢我的妻子王小姣六年来对我的理解和支持；感谢我的父母对我学习上的支持和生活上的关怀，是他们的辛苦劳作换来了我今天的学业。本项目受国家自然科学基金项目(31071647)和公益性行业(农业)科研专项(NO．201103016)资助。余洋2012年6月于武汉 核盘菌菌核形成相关蛋白Ss-S12功能研究附录1：各种培养基、溶液、试剂及药品配方1．常用培养基配方：马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)：马铃薯200g，葡萄糖20g，加水至1000ml。加15g琼脂即为PDA。牛肉膏蛋白胨培养基(LB)：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl5g，调节pH至7．0，补水至1000ml，固体培养基加1．5％琼脂粉。YPSS培养基：酵母浸膏4g，蔗糖15g，K2HP0411g，MgS040．5g，补水至1000ml。SOB培养基：蛋白胨20g，酵母浸膏5g，NaCI10g，完全溶解后加入10ml250MKCl，调节pH至7．0，补水至1000ml，高压灭菌，使用前加入5“2MMgCl2。SOC培养基：1LSOB加20IId1M葡萄糖溶液(过滤除菌)。2．常用抗生素配方：卡那霉素(10mg／m1)：称取10mg卡那霉素溶解于1IIll的灭菌的双蒸水中，用细菌过滤器过滤除菌，配成10mg／ml溶液，于一20℃贮存备用。头孢霉素(100mg／m1)：称取100nag头孢霉素溶解于1Illl的灭菌的双蒸水中，用细菌过滤器过滤除菌，配成100mg／ml溶液，于-20℃贮存备用。氨苄青霉素(50mg／m1)：称取50mg氨苄青霉素溶解在1“的灭菌的双蒸水中，用细菌过滤器过滤除菌，配成50mg／ml溶液，于-20℃贮存备用。氯霉素(34mg／m1)：称取34mg氯霉素溶解在1IIll无水乙醇中，配成34mg／ml溶液，于．20℃贮存备用。利福平(10mg／m1)：称取10mg利福平溶解在1IIll无水乙醇中，配成10mg／ml溶液，于．20℃贮存备用。新霉素(100pg／m1)：称取100Pg新霉素溶解在1111l灭菌双蒸水中，用细菌过滤器过滤除菌，配成100lxg／ml溶液，于-20℃贮存备用。3．农杆菌介导转化所用药品与培养基配方： 华中农业大学2012届博士研究生学位论文O．1M的乙酰丁香酮(AS)：称取196．2mgAS，用二甲亚砜(DMSO)直接溶解，定容到10llll，配成O．1M溶液，分装于无菌1．5111l离心管中，置于．20℃贮存。磷酸氢钾缓冲液(K-Buffer)：K2HP04200g，KH2P04145g，补水至1000ml。硫酸镁-氯化钠溶液(M-NBuffer)：MgS04·7H2030g，NaCl15g，补水至1000ml。基本培养基(MinimalMedium，MM，Hooykaaseta1．，1979)：K．buffer10ml，M-Nbuffer20ml，20％glucose(w／v)10ml，0．01％FeS04(w／v)10ml，20％(NH4)2S04(w／v)2．5ml，1％CaCl2-2H20(w／v)1Ⅱd，补去离子水(ddH20)至1000ml，用H3P04或NaOH调节pH为6．7．7．0。诱导培养基(InductionMedium，IM，Hooykaaseta1．，1979)：K．buffer10ml，M-Nbuffer20rIll，20％glucose(w／v)5ml，0．01％FeS04(w／v)10ml，20％(NH4)2S04(w／v)2．5IIll，1％CaCl2·2H20(w／v)1ml，50％Glycerol(w／v)10ml，MES7。808g，补去离子水(ddH20)至1000ml，用H3P04或NaOH调节pH为5．6。加入1．5％的琼脂即为共培养基(CO．IM)。4．SDS．PAGE电泳所用试剂及溶液配方：lxSDS上样缓冲液：65mMTris·HCl(pH6．8)，10％甘油(v／v)，2．3％SDS(w／v)，0．01％溴酚蓝，1％巯基乙醇。丙烯酰胺储存液(A液)：30％(W／V)丙烯酰胺，0．8％(w／v)双丙烯酰胺。4×分离胶缓冲液(B液)：2MTris—HCl(pH8．8)75ml，10％SDS4ml，21ml蒸馏水。4x浓缩胶缓冲液(C液)：1MTris—HCl(pH6．8)50ml，10％SDS4ml，46ml蒸馏水。12％SDS-PAGE分离胶(10m1)：A液4IId，B液2．5面，10％过硫酰胺50山，TEMED5山，蒸馏水3。5rnl。5％SDS—PAGE浓缩胶(4rnl)-A液O．67“，C液1ml，10％过硫酰胺30m，TEMED5m，蒸馏水2．3“。10xTris-甘氨酸电泳缓冲液：Tris15．1g，甘氨酸94g，10％SDS50ml，加蒸馏水定104 鳖垄堕堕鳖垄盛塑羞量自墨!：兰!兰垫丝堑壅．．一_————————————————————————————————一容至1000ml，调节pH值至8．3。考马斯亮蓝染色液：甲醇45ml，蒸馏水45ml，冰乙酸10ml，考马斯亮蓝G250或R2500．25g。蛋白质脱色液：甲醇45ml，蒸馏水45ml，冰乙酸10ml。蛋白切胶缓冲液：0．5MKCl，低温保存。5．血清学相关试剂配方：0．01mo儿PBS缓冲液：NaCl8．0g，Na2HP04·121-1202．7g，NaH2P04。2H20O．4g，加蒸馏水定容至1000ml，调节pH至7．4。0．01ln01／LPBST洗涤缓冲液：0．01mol／LPBS缓冲液添加0．05％的Tween。20。0．05mol／L碳酸包被缓冲液：Na2C031．5g，NaHC032．93g，加蒸馏水定容至1000ml，调节pH至9．6。辣根过氧化物酶底物缓冲液：柠檬酸10．5g，乙酸钠6．8g，加蒸馏水定容至1L，调节pH值至5．0，低温保存。使用前加四甲基联苯胺(TⅧ)母液至终浓度为0．Img／ml，并在每毫升底物缓冲液液中加入1山30％的H202。0．5％TMB溶液：0．5gTMB溶入80ml无水酒精中，定容至100ml，低温避光保存。6．核盘菌蛋白提取相关试剂配方：核盘菌总蛋白提取缓冲液：1MSorbitol，10mMHEPES，5mMEDTA,0．1MKCl，0．2％TritonX-100，pH8．0。裂解缓冲液：10mMTris-HCl：lmMPMSF。SDS蛋白提取缓冲液：50mMTris-HCl(pH8．0)，10mMEDTA,2％SDS，10mMDTT。7．Westernblot相关试剂配方：电转移缓冲液：甘氨酸2．9g，Tris5．8g，SDS5．85g，甲醇200ml，用HCl调节pH105 ———————————————j皇生垄些丝Q!兰星蔓圭堑壅生堂焦笙奎值至8．3，加蒸馏水定容至1000ml。封闭液：称取0．5g脱脂奶粉溶于10IIllPBST中。NBT／BCIP底物缓冲液：Tris2．1g，NaCl0．585g，MgCl2．6H：O0．012g，用HCl调至pH值至9．5，定容至100ml，避光保存。显色液：使用前在NBT／BCIP底物缓冲液中加入NBT至终浓度为0．33mg／ml，BCIP至终浓度为0．175mg／ml。8．DNA、质粒抽提所用到的缓冲液DNA提取缓冲液：2％CTAB，2％PVP，100mMTris．HCl(pH8．0)，25n蝴EDTA，2．0MNaCl，无需灭菌。质粒提取用的溶液按《分子克隆实验指南》配制，其中：溶液I：10mMpH8．0EDTA，25mMTris．HCl(pH．O)，50I洲葡萄糖。溶液II：0．2MNaOH，1％SDS。溶液Ⅲ：29．442gKAc，11．5ml冰醋酸，加蒸馏水定容至lOOml。9．Southem杂交所用试剂配方：预杂交与杂交用溶液及试剂按《分子克隆实验指南》配制，其中：20xSSC：NaCl175．3g，柠檬酸钠(Na3C6Hs07·2H20)88．2g，加水定容至1000ml，用10MNaOH溶液调节pH值至7．0，分装后高压灭菌。变性液：0．25MHCI。中和液：O．1MNaOH，O．1MTris．C1pH8．0。漂洗液：10×SSC。核酸杂交缓冲液(Churchbuffer)：1％BSA，1mMEDTA，0．25MNa2HP04-NaH2P04(pH7．2)，7％SDS。10．酵母感受态制备及转化相关试剂：1．1xTE／LiAC：11mMTris—HCI(pH7．5)，1．1mMEDTA，0．11ML认c。106 核壅堕堕垫垄盛塑苤星自墨!：墨!兰边墼堑壅．一————————————————————————————————一一PEG／LiAC：40％PEG4000，10m／VlTris．HCI(pH7．5)，1mMEDTA，0．1MLiAc。11．其它所用药品配方：IPTG(1mol／L)：称取1gIPTG溶于4．2ml双蒸水中，过滤除菌后分装，于-20℃保存。X．0【．Gal(20mg／“)：称取20mgX-a．Gal溶于1ml的二甲基甲酰胺(DMF)中，于．20℃保存。TE：10nlIIlol／LTris．HCl(pH8．0)，1mmoFLEDTA(pH8．0)，含20mg／ml的RNase。0．5MEDTA(pH8．0)：在800“水中加入186．1g二水乙二胺四乙酸二钠，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节pH至8．0，然后定容至1000lIll，分装后高压灭菌备用。10×TBE电泳缓冲液：Tris108g，硼酸55g，0．5MEDTA40ml，JJlTg至1000ml。TBS：50rnlVlTris(pH7．4)，150rnlVlNaCI。107 华中农业大学2012届博士研究生学位论文附录2：已发表的相关文章Yang№DaohongJiang，JiataoXie，JiasengChen,GuoqingLi，XianhongYi，YanpingFu．Ss—S12，anovelcellwallproteinwithPANmodules，isessentialforsclemtialdevelopmentandcellularintegrityoftheplantfungalpathogenSclerotiniasclerotiorum．PLoSONE，2012，7(4)：e34962．doi：10．1371／journal．pone．0034962．余洋，付艳苹，姜道宏，程家森，谢甲涛，李国庆，易先宏．核盘菌菌核形成相关基因SS-SOMI的初步研究．中国植物病理学会2009年学术年会论文集，2009，昆明．余洋，江明，姜道宏，付艳苹，李国庆，易先宏．一种提高农杆菌介导转化核盘菌的新方法．植物病理学研究进展．2007，武汉．腾飞，谢甲涛，余洋，姜道宏，付艳苹，李国庆，易先宏．核盘菌弱毒相关病毒(SsDRV)感染雪腐核盘菌的研究．植物病理学研究进展．2007，武汉．
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