par-2基因沉默对食管癌ec109细胞增殖及侵袭转移的影响

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1、目录IIIIIMUlIIItlHIIIIIIIIIIIIY2397831中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4研究论文PA融2基因沉默对食管癌ECl09细胞增殖及侵袭转移的影响前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一⋯8日IJ吾⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．8材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．9结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯22附图⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯25附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36综述蛋白酶激活受体．2及RNA干扰技术在食管癌中的作用研究进展41致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一52中文摘要PAR一2基因沉默对食管癌ECl09

3、细胞增殖及侵袭转移的影响摘要目的：食管癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一，我国是食管癌高发区。食管癌早期缺乏特异临床表现，大部分食管癌患者就诊时已经属于晚期，近年来虽然手术及放射、化学疗法在食管癌治疗方面取得了一定的进步，但是5年总体生存率仍然低于20％。食管癌细胞增殖、转移是影响患者疗效和预后的重要因素，也是当前食管癌研究中最重要的一个方面。蛋白酶激活受体．2(Proteinase-activedreceptors2，PAR-2)属于细胞膜表面受体，是与G蛋白相耦联的蛋白酶激活受体超家族成员，胰蛋白酶、类胰蛋白酶、凝血

4、因子等是该受体的天然激动剂，PAR．2受激活后可引起一系列关于肿瘤侵袭、转移、增殖生长等方面的生物学行为。我们的前期研究发现食管癌细胞ECl09表达PAR-2，PAR-2激活后可使基质金属蛋白酶分泌增加，从而促进ECl09细胞的运动、侵袭能力。RNA干扰(RNAi)是由小分子干扰RNA(siRNA)介导的一种转录后基因沉默技术，siRNA通过与靶mRNA特异性互补配对，引起靶mRNA降解或抑制其翻译，从而使靶基因表达抑制。RNA干扰因其对靶基因的沉默具有高度的特异性和强大的抑制作用，正越来越多地应用于多种疾病的预防和

5、治疗研究。本实验通过PAR-2基因靶向shRNA表达质粒转染食管癌ECl09细胞，建立PAR-2基因沉默的稳定细胞株，进而来研究PAR-2基因沉默对食管癌ECl09细胞增殖和侵袭迁移能力的影响。方法：针对人PAR-2的mRNA序列，设计并体外合成编码shRNA的两条特异性寡核苷酸序列，分别插入pGFP：V-R$’质粒载体中构建两个shRNA表达质粒(PAR-2shRNA．1、PAR-2shRNA．2)，经过鉴定，然后将表达质粒转染至食管癌细胞ECl09中，经嘌呤霉素筛选，获得稳定干扰的细胞株，运用RT-PCR和Wes

6、temBlot法检测PAR．2的表达，从而筛选出最佳干扰序列的稳定细胞株PAR．2shRNAECl09；运用MTT及流式细胞术法检测PAR-2shRNAECl09细胞增殖能力及细胞周期的变化；Transwell小室法检测PAR-2基因沉默前后细胞侵袭和迁移能力的变化。结果：中文摘要1构建PAR-2基因靶向shRNA表达质粒并测序鉴定成功构建了PAR-2基因靶向shRNA表达质粒，质粒测序鉴定结果显示重组质粒PAR-2shRNA．1、PAR-2shRNA-2与设计的靶向PAR-2的寡核苷酸序列比较完全一致。2通过RNA

7、i技术成功筛选出了PAR-2基因表达下调的食管癌PAR-2shRNAECl09稳定细胞株2．1重组质粒转染ECl09细胞的RT-PCR结果显示PAR-2shRNA．1组、PAR-2shRNA-2组、非特异性序列转染组和空白对照组，四组吸光度的比值分别为0．35i-0．03、0．43+0．04、0．4钍0．04、0．454-0．41。PAR-2shRNA．1组PAR-2mRNA相对表达显著降低，与另外三组比较差异有显著意义(P

8、A相对表达差异无显著性(P>O．05)。2．2重组质粒转染ECl09细胞的Westem-Blot结果显示四组灰度比值分别为0．96土0．01、1．04：J：0．02、1．05：1：0．04、1．09a：0．04。PAR-2shRNA-1组础峨2蛋白的表达明显减少，与另外三组相比差异有显著意义(P