基于转录组测序的超积累型东南景天内参基因筛选与hsf基因家族初步分析

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1、中国抹董舛学绚宪院学位论文学位论文作者指导教师姓名指导小组成员申请学位级别专业名称研究方向论文答辩日期桑健卓仁英研究员周功克研究员刘明英副研究员硕士生物化学与分子生物学植物抗逆功能基因组学2014年6月◎中国·北京DissertationfortheDegreeCandidate：SangJianSupervisor：ProfessorZhuoRenyingAssociateSupervisor：AcademicDegreeAppfiedfor：Speciality：DateofDefence：ProfessorZhouGongkeAssociateProfessorLiuMingyin

2、gDegree·-Conferring——Institution：ChineseAcademyofForestry㈣8㈣5㈣瓢Ⅲ9㈣2咖6川2删Y独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得本研究生培养单位或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位敝储虢靴眺z口怍6月z6日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解中国林业科学研究院有关保留、使用学位论文的规定

3、，中国林业科学研究院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权中国林业科学研究院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：20／千年彩月2石日导师签名：枷中年易月学位论文作者毕业联系方式工作单位：中国林业科学研究院亚热带林业研究所联系电话：15957133774电子邮件：xysjl989@126．com，k坪气二叼1日，通讯地址、邮编：浙江省杭州市富阳市大桥路73号311400摘要超积累型东南景天是于我国东部地区的古老铅锌矿区

4、中发现的一种对镉、铅、锌都具有超积累作用的植物。前人已在生理学水平上对其重金属耐受性及超积累性进行了描述，但由于可供参考的基因序列信息极为有限，目前在该物种中尚未开展大规模的分子生物学研究以阐述其分子机制。为了有效地挖掘与重金属耐受性及超积累性相关的胁迫应答基因，我们对超积累型东南景天进行转录组测序，并在此基础上对RT-qPCR技术所需要的内参基因进行筛选。最后在转录组水平上对超积累型东南景天HSF基因家族成员进行初步分析。本研究主要得出以下结论：1．通过IlluminaHiSeqTM2000高通量测序平台对超积累型东南景天进行转录组测序，共得到44，495，628条原始Reads，总碱

5、基数达到8,851，634，796nt。组装后获得4,362，725个Contigs和87，721条Unigene。其中长度在500bp以上的Unigene共27，553个，占Unigene总数的31．41％。经Nr、Nt、SwissProt、GO、COG与KEGG数据库比对之后，共有62，101条Unigene获得了功能注释，占Unigene总数的70．79％。经进一步分析之后，初步地鉴定出470条潜在的重金属胁迫应答Unigene。2．利用生物信息学方法从上述转录组数据中挖掘出10个内参基因的候选基因，包括5个传统内参基因(彳C刀，TUB，GADPH，ⅧC9，肛，6c)和5个使用频率

6、较低的新内参基因(SAND，TIP41，么尸-2，乃P，APT)。利用RT-qPCR技术对十个候选基因在镉、铅、锌、铜四种重金属胁迫七个时间点下的表达模式进行测定，通过geNorm、NormFinder和BestKeeper三个算法不同的程序对候选基因的稳定性进行评估，筛选出两个稳定表达的内参基因UBC9和TUB。为了验证其可靠性，将ⅧC9和TUB分别作为内参基因分析植物螯合肽合成酶(勋P四)在四种重金属胁迫下的表达模式，结果表明这两个候选内参基因均可以完成对靶标基因RT-qPCR结果的标准化分析。3．利用生物信息学方法从上述转录组数据中初步挖掘出11个具备完整HSF结构域的热激转录因子

7、基因家族成员(SaHsf)。将它们与25个水稻OsHsf基因和21个拟南芥AtHsf基因进行聚类分析，并构建系统发生进化树，结果表明SaHsf基因在热激转录因子三个亚家族A(8个)、B(2个)、C(1个)中均有分布。通过CodonW程序对SaHsf基因家族成员进行同义密码子偏好性分析初步鉴定出28个偏好密码子，近一步分析发现SaHsf基因偏爱以～T结尾的密码子。利用RT-qPCR技术对镉、铅、锌、铜四种重金属胁迫条件下11个SaHs