氧化应激晶状体上皮细胞中黏着斑激酶的表达

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文氧化应激晶状体上皮细胞中黏着斑激酶的表达Theexpressionoffocaladhesionkinaseinhumanlensepithelialcellstreatedwithhydrogenperoxide课题来源：广东省自然科学基金项目学位申请人黄煜导师姓名郭海科专业名称眼科学培养类型学术型培养层次硕士研究生所在学院研究生学院年月日广州硕士学位论文氧化应激晶状体上皮细胞中黏着斑激酶的表达硕士研究生：黄煜指导教师：郭海科摘要背景晶状体上皮细胞(1ensepithelialcells，LECs)是位于晶状体前囊膜下的一层

2、单层立方上皮细胞，其代谢活跃，具有生长、分化和创伤刺激后发生愈合反应的能力。晶状体上皮细胞起到对晶状体的营养、代谢、损伤修复作用，是维持晶状体透明性的最重要的防线，任何原因(如衰老、营养代谢异常、中毒变性、外伤等)破坏LECs的正常结构和功能，都可能导致不同类型的晶状体混浊。在既往的研究中，人们通过对比正常人与白内障患者的LECs，发现白内障患者LECs有三个特点：形态改变、密度下降、局部增殖导致细胞复层排列或向后囊移行。这些形态结构的异常，是晶状体发生浑浊的机制之一。因此，研究晶状体上皮细胞的形态、结构、凋亡等生物学特性是研究晶状体疾病的重要基础。白内障的发

3、生发展与晶状体长期处于氧化应激状态有密切的联系。通常认为，过量的氧化应激是外界各种致白内障因素作用的共同途径，它激活一系列的细胞内信号通路，最终因损伤LECs而导致晶状体的浑浊。在众多导致细胞氧化应激的物质中，过氧化氢(hydrogenperoxide，H202)是最重要的物质。正常人的晶状体及房水中存在一定数量的自由基，其中H202的浓度约为20．309mol／L，而在白内障患者的房水中可高达6609mol／L，为正常患者的30倍。由于氧化应激，LECs膜通透性改变，细胞内的蛋白质漏出，房水成分发生改变，细胞内环境改变，稳定性下降；细胞内蛋白质结构发生改变，

4、细胞生理功能、透明度受到影中文摘要响；DNA受损，晶状体上皮细胞凋亡，进而无法供给晶状体代谢所需的营养物质，加重氧化应激的损害。这一系列的变化都能导致晶体的浑浊。氧化应激激起了白内障发生、发展过程中恶性循环。可见，H202诱导LECs的氧化损伤是白内障发生发展的起始途径，研究晶状体上皮细胞的氧化应激机制是研究年龄相关性白内障发生发展机制的重要方面之一。黏着斑激酶(Focaladhesionl(inaSe，FAK)是一种位于细胞质的非受体型酪氨酸激酶。FAK自发现起至今已近20年，目前认为FAK在诱导细胞增殖、细胞粘附、迁移、抗凋亡、纤维化、分化方面都起到了一定

5、的作用。(1)在细胞增殖方面，细胞与ECM的连接是细胞增殖的必要条件。整合素与细胞外基质连接后，在生长因子的刺激下，FAK被激活，通过MAPK或P13K的激活促进细胞增殖。(2)在细胞粘附移行方面，已有大量研究证实FAK与细胞的移行有重要的关系，而且细胞的移行依赖于细胞外基质(extracellularmatrixc，ECM)．整合素．FAK这一系列因素的相互作用。(3)在抑制凋亡方面，FAK家族对细胞有不同的影响。抑制FAK能导致细胞的凋亡，这可能与P13．K／Akt．1和MEK／Erk信号通路相关。总而言之，由于FAK位于多条信号通路的上游，其对细胞生物行

6、为的各个方面都起到一定的调节作用。目的通过过氧化氢处理晶状体上皮细胞，制造氧化应激模型，研究氧化应激晶状体上皮细胞的增殖、移行、凋亡、及形态学的改变，同时，观察细胞内黏着斑激酶的动态表达及活化程度，初步探讨黏着斑激酶是否对氧化应激晶状体上皮细胞的调控功能。方法：1、晶状体上皮细胞培养与处理：人晶状体上皮细胞(HLECs)细胞株，购自美国ATCC。细胞用含有10％FBS的低糖DMEM培养基培养，于37"C、体积分数5％NC02饱和湿度的细胞培养箱内培养。细胞达到80％．90％霆11合后，用不含血清、H202含量分别为0,30，50，70，100，300，500，

7、700，10009mol／L的低糖DMEM细胞0,30min，3h，6h，12h，24h。硕士学位论文2、CCK．8法检测细胞存活率：将细胞密度调至1x108／L，并将细胞悬液接种于96孔培养板，每孔100肛L，置37。C，体积分数5％C02培养箱中孵育，24h细胞贴壁后弃上清，对照组(H202浓度为01amol／L)加100pL低糖DMEM培养液，处理组分别加入14202浓度为30，50，70，100，300，500，700，10009mol／L的低糖DMEM1009L，每组设六个复孔，继续孵育30min，3h，6h，12h，24h。避光取出，弃上清，PBS

8、洗涤两次，每孔加入100pL培养基和1