草鱼Fibulin-4蛋白与草鱼呼肠孤病毒蛋白的相互作用研究

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1、上海海洋大学硕士论文学校代码：10264研究生学号：M150104128上海海洋大学硕士学位论文草鱼Fibulin-4蛋白与草鱼呼肠孤病毒蛋论文题目：白的相互作用研究TheinteractionbetweengrasscarpFibulin-4英文题目：proteinwithgrasscarpreoviousproteins专业：临床兽医学研究方向：水产动物病毒学姓名：盛佳璐指导教师：吕利群二0一八年五月上海海洋大学硕士论文上海海洋大学硕士论文上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注刘万红武汉大学教授主席黄赞武汉大学教授委员徐鸿绪中山大学教授委员张俊彬深圳大学教授

2、委员姜有声上海海洋大学副教授委员喻飞/王浩上海海洋大学博士生/博后秘书答辩地点病原库D101答辩日期2018.05.19上海海洋大学硕士论文摘要Fibulin家族蛋白属于分泌型糖蛋白，主要与包括基底膜和弹性微细纤维在内的细胞外基质的各种结构组件相互作用，参与细胞外基质的构成并维持其稳定。Fibulin蛋白可以调节各种细胞过程如细胞生长、分化，血管生成及肿瘤生长，然而，它们在骨骼发育和疾病方面的作用仍不清楚。草鱼(Ctenopharyngodonidella)为我国主要淡水养殖品种，占全国鱼类养殖产量首位，至今仍在长江中下游暴发流行，波及全国，年死亡损失超过30%，严重危害草鱼养殖业的发

3、展。研究草鱼呼肠孤病毒蛋白与宿主蛋白的相互作用有助于阐明病毒蛋白的生物学功能及病毒致病机理。利用前期本实验室的酵母双杂交筛选与GCRV-JX01的VP7和GCRV-JX02W的VP56相互作用的蛋白，共同筛选出了一个细胞外基质蛋白Fibulin-4，进一步发现Fibulin-4在草鱼的肌肉、脑、肠道中表达水平较高，这与临床中草鱼出血病的红肌肉、红鳃盖和红肠症状相吻合。我们尝试运用分子生物学和细胞生物学方法进一步验证Fibulin-4与两种GCRV外衣壳蛋白之间的相互作用。本课题主要从以下三点进行研究：1杆状病毒表达II型呼肠孤病毒外突VP56蛋白提取本实验室分离保存的GCRV-JX02

4、W株的RNA，根据JX02W株S7基因序列，设计构建pFastbacHTA-S7的引物，采用RT-PCR技术扩增获得S7目的片段，将质粒pFastbacHTA-S7转入自己制备的DH10感受态，涂布卡那，庆大霉素，四环素的三抗LB平板，成功转座后，放入含50μg/mL卡那霉素，7μg/mLTM庆大霉素，10μg/mL四环素的LB液体培养基中过夜培养，使用PureLinkHipure试剂盒提取杆粒DNA。提取的重组杆粒DNA鉴定且测序正确后，使用转染试剂®CellfectinIIReagent，于六孔板转染昆虫细胞SF9，待细胞出现明显病变现象时，收集细胞及分离病毒上清，运用His60N

5、iSuperflowResin纯化试剂盒纯化His-VP56蛋白，用His标签抗体检测VP56的表达，结果显示自转染96h起，转染杆粒的细胞生长停滞，不断裂解。Westernblot结果显示表达了重组蛋白VP56，大小约为62KDa，为可溶蛋白，为研究其自身生物功能和进一步研究病毒与草鱼宿主细胞蛋白相互作用以及研究基于杆状病毒表达载体的GCRV新型基因工程疫苗奠定了基础。2Fibulin-4与GCRV-JX01的VP7，GCRV-JX02W的VP56的相互作用关系I上海海洋大学硕士论文的鉴定成功构建重组质粒pEGFP-Fibulin-4和pDsRed1N1-VP7与pDsRed1N1-

6、VP56，将pDsRed1N1-VP7，pDsRed1N1-VP56分别与pEGFP-Fibulin-4共转入草鱼性腺细胞GCO。经DAPI染色，亚细胞定位显示，病毒蛋白VP7，VP56和草鱼蛋白Fibulin-4均分布于细胞质中，两种蛋白都与Fibulin-4有部分重叠。构建质粒pGEX-4T-3-Fibulin-4，利用尿素纯化蛋白，纯化的蛋白免疫小鼠，制备了Fibulin-4的多克隆抗体。纯化自己表达的VP56蛋白和实验室已表达的VP7蛋白。应用Dot-blotoverlay技术，将原核表达纯化获得的GST与GST-Fibulin-4蛋白倍比稀释杂交到PVDF膜上，经过His-V

7、P7，His-VP56蛋白的孵育，用anti-his检测信号，结果显示随着杂交的蛋白量从低到高，蛋白信号由弱到强。His-VP7与His-VP56都能够吸附在GST-Fibulin-4蛋白上发生相互作用，而不能吸附GST蛋白。利用pulldown技术，采用Pierce™pull-DownPolyHisProtein：ProteinInteractionKit试剂盒，裂解细胞表达的GFP蛋白与GFP-Fibulin-4蛋白与结合His-VP7，H