吴茱萸admetox特征及肝靶活性-毒性机制研究

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1、泸州医学院硕士学位论文中图分类号：R89；R36；R39硕士学位论文吴茱萸ADME/Tox特征及肝靶活性-毒性机制研究院（系）、所药学院研究生姓名李波学科、专业药理学导师姓名赵军宁研究员二Ο一三年四月泸州医学院硕士学位论文目录1吴茱萸ADME/TOX特征及肝靶活性-毒性机制研究………11.1中文摘要………………………………………………………11.2英文摘要………………………………………………………41.3前言……………………………………………………………71.4实验研究………………………………………………………101.5结果…

2、…………………………………………………………131.6讨论……………………………………………………………371.7结论……………………………………………………………441.8参考文献………………………………………………………471.9英汉缩略词对照表……………………………………………522致谢……………………………………………………………53文献综述………………………………………………………543吴茱萸药理毒理研究进展……………………………………54泸州医学院硕士学位论文吴茱萸ADME/Tox特征及肝靶活性-毒性机制研究摘要目

3、的：1.建立人L-02肝细胞模型和Caco-2细胞模型，并验证其稳定性。在此基础上建立了Caco-2/L-02肝细胞联合模型——ADME/Tox并联测试体系。2.利用该体系考察吴茱萸水提物（WZY）体外吸收成分的吸收、代谢特征和毒性机理。方法：1.参照本实验室前期的方法，通过跨膜电阻（TEER）的测定和Caco-2细胞形态观察，评价Caco-2细胞模型的紧密性与完整性。2.L-02肝细胞模型的建立和验证：按常规培养L-02肝细胞，通过细胞形态观察、台盼蓝染色测定肝细胞存活率及肝细胞培养上清液中白蛋白（ALB）和尿素氮(BUN)

4、的含量，判断其分泌功能来评价L-02肝细胞模型的可靠性。3.Caco-2/L-02肝细胞联合模型及WZY的ADME/Tox研究：将Caco-2细胞模型与L-02肝细胞模型结合起来，建立ADME/Tox并联测试体系——Caco-2/L-02肝细胞联合模型，并同时考察WZY在体外的吸收、代谢过程及毒性情况。在联合模型顶侧（AP侧）加入WZY，底侧（BL侧）收集代谢样品，用LC/MS法检测经过联合模型、Caco-2细胞和肝细胞模型吸收、代谢后的WZY的成分变化；通过生化、ELISA测定BL侧的代谢样品，评价WZY代谢物对肝细胞的损伤

5、作用。结果：1.Caco-2细胞模型：结果显示Caco-2细胞单层紧密性和完整性良好，表明该模型可以用于研究药物的体外转运过程。2.L-02肝细胞模型：按常规培养L-02肝细胞，24小时后，肝细胞已经贴壁，培养3天的肝细胞镜下可见相互之间连接成片；存活率在95%-98%之间；L-02肝细胞培养3天，其尿素氮和白蛋白分泌功能达到高峰。所以，以第3天为给药时间。3.将可用的Caco-2细胞（Millicell膜）提出，轻放入种有L-02肝细胞的6孔板上，即得联合细胞模型。本文成功建立了WZY代谢物中两个有效成分的1泸州医学院硕士学

6、位论文LC/MS测定方法。色谱条件：色谱柱：WelchMaterialsXtimate-C18，(2.1×150-1mm,3µm)；流动相：甲醇-水（85:15）含10mmol.L乙酸铵；流速：0.2-1ml.min；柱温：30℃。质谱条件：正离子模式，采用电喷雾离子化源(ESI)，雾化气为氮气，雾化压力为40psi；喷雾电压4000V，源温度为100℃；碰撞气为高纯氮气，压力为0.1MPa；去溶剂气为氮气，温度350℃，流速为10L/min；采用MRM模式对药物检测。结果表明本方法的专属性、精密度、准确度及定量线性范围均符合

7、要求，该方法能同时快速准确测定WZY中吴茱萸碱（EVO）、吴茱萸次碱（RUT）的含量。结果显示，WZY经过联合模型吸收并代谢，联合模型组中EVO成分在1h、2h、24h的含量分别为2.53±1.60µg，4.57±0.03µg，15.86±0.06µg；RUT成分的含量分别3.56±1.49µg，5.87±0.09µg，18.70±0.21µg。Caco-2细胞模型中EVO成分在1h、2h、24h的含量分别为3.55±0.47µg，5.11±0.02µg，21.82±0.76µg；RUT成分的含量分别4.63±0.15µg，8

8、.31±0.14µg，22.00±0.85µg。肝细胞模型中EVO成分在24h的含量为79.85±0.15µg；RUT成分的含量为57.96±0.11µg。WZY经联合模型吸收代谢2h、24h后，其中EVO、RUT两成分含量均低于caco-2细胞模型组(p<0.01)。生化测