trv介导的大豆基因瞬时沉默体系建立及其在大豆基因功能分析中的应用

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1、AGRICULTURALUNIVERSITYOFHEBEI硕士学位（毕业）论文TRV介导的大豆基因瞬时沉默体系建立及其在大豆基因功能分析中的应用学位申请人：刘晓彬指导教师：王冬梅教授学科专业：细胞生物学学位类别：理学硕士授予单位：河北农业大学。答辩日期：二〇一五年五月二十九日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导帅指导下进行的研究工作及取得的研究成果。椐我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发农或撰写过的研究成果，也不包含为获得河彳匕农业大学或其他教育机构的学位或诎书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任

2、何贡献均已在论文屮作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字FI期：年/月g-Pi学位论文版权使用授权书木学位论文作者完全了解河北农业大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。木人授权河北农业大学可以将学位论文的令部或部分内容编入有关教抿症讲行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名:导师签名:签字R期：pd签字h期：年L月学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话:通讯地址:邮编:分类号：S565.1单位代

3、码：10086密级：公开学号：2012058TRV介导的大豆基因瞬时沉默体系建立及其在大豆基因功能分析中的应用EstablishmentofTRV-mediatedTransientGene-silencingSystemandItsApplicationinSoybean学位申请人：刘晓彬指导教师：王冬梅教授学科专业：细胞生物学学位类别：理学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一五年五月二十九日英文缩写表Abbreviation英文缩写英文名称中文名称VIGSVirus-inducedgenesilencing病毒诱导的基因沉默TRVTobac

4、corattlevirus烟草脆裂病毒SMVSoybeanmosaicvirus大豆花叶病毒NCBINationalCenterforBiotechnology美国国立生物技术信息中Information心RNARibonucleieacid核糖核酸mRNAMessengerridonucleicacid信使核糖核酸cDNAComplementaryDNA互补DNAPCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应AmpAmpicillin氨苄青霉素KanKanamycin卡那霉素RifRifampicin利福平MES2-(N-mor

5、pholino)ethanesulfonicacid吗啉乙碳酸LBLuria-BertanibrothLB培养基ddH2ODoubledistilledwater双蒸水RT-PCRreversetranscription-PCR反转录PCRODOpticalDensity光密度AsAcetosyringone乙酰丁香酮摘要病毒诱导的基因沉默(Virus-inducedgenesilencing,VIGS)技术已在植物基因功能研究领域得到广泛应用。为了将烟草脆裂病毒（Tobaccorattlevirus,TRV）介导的基因沉默技术应用于对大豆基因的功能

6、研究，本试验建立了以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系，并利用该体系对大豆中与大豆抗大豆花叶病毒（SMV）相++关的胼胝质合酶基因（GmCalS7）和与大豆抗盐性相关的Na-H逆向转运蛋白基因（GmNHX1/GmNHX5）进行了功能分析。试验获得的主要结果如下：1.选用大豆八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因为标记基因，首先构建了该基因的沉默载体TRV:GmPDS，向大豆叶片注射携带有TRV:GmPDS的农杆菌，在注射后第25天，上部未接种病毒的叶片出现了白化现象，通过半定量RT-PCR分析，发生白化的植株中GmPDS基因被有效沉默。2.向大豆叶片注

7、射携带有TRV的农杆菌后再接种SMV，发现先接种TRV对大豆接种SMV的抗性表现没有影响。3.构建了GmCalS7基因的沉默载体TRV:GmCalS7，向大豆叶片注射携带有TRV:GmCalS7的农杆菌，以注射只携带TRV的农杆菌作对照，在注射后第25天：1)取第二轮复叶做半定量RT-PCR分析，注射TRV:GmCalS7的植株中GmCalS7被有效沉默。2)对转基因植株接种大豆花叶病毒（SMV）株系N3,在接种SMV后96h，在荧光显微镜下检测转基因植株的胼胝质。GmCalS7沉默植株的胼胝质较对照植株明显减少。3)转基因植株接种SMV株系N3的当

8、位叶均能检测到SMV的外壳蛋白基因CP的表达，在GmCalS7沉默植株的未接种上位叶片中也能够检测到极微量C