成人原代肝细胞的分离、鉴定及其蛋白质合成与p450表达

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1、硕士学位论文成人原代肝细胞的分离、鉴定及其蛋白质合成与P450表达学科专业内科学学位类型□√科学学位□专业学位研究生姓名覃玉燕导师姓名、职称唐世刚教授论文编号湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一五年五月分类号密级学校代码10542学号201202201524成人原代肝细胞的分离、鉴定及其蛋白质合成与P450表达Isolation、identificationandtheproteinsynthesisofadultprimaryhepatocyte,andtheexpressionofP450研究生姓名覃玉燕指导教师姓名、

2、职称唐世刚教授学科专业内科学研究方向肝细胞移植湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一五年五月湖南师范大学学位论文原创性声明，本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下独立进行研究工作所取得的成果。除文中＆经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体己鐘发表或撰写过的作品成果。对本文Ｌ。本的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中Ｘ明确方式标明人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。？＾学位论文作者签名：Ｖ％尽年月咐琴湖南师范大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有

3、关保留、使用学位论文的规定，研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属湖南师范大学。同意学校保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师苑大学可Ｋ将本学位论文的＾全部或部分内容编入有关数据库进行检索１、，可义采用影印缩印或担描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于１、保密年解密后适用本授权书。２、不保密＂＂’ＬＶ）（请在乂上相应方框内巧ＰＨ期■曰作者签名：咳：价＾、导师签名：曰期：年户月曰中文摘要目的：探讨手术切除

4、的成人良性病变肝叶的肝细胞分离及细胞鉴定技术，研究成人原代肝细胞培养过程中的细胞活力的改变，及蛋白质合成与细胞色素P450表达的变化。方法：选择肝脏良性病变的手术切除肝叶标本，采用改良胶原酶灌注分离法分离肝细胞,用血球计数板计数法对分离后的新鲜肝细胞计数，台盼蓝拒染法检测新鲜肝细胞活率；利用过碘酸-schiff（PAS）反应来检测肝细胞的糖原合成能力，并利用免疫组织化学方法来测定肝细胞角蛋白CK18的表达联合判断肝细胞纯度；用CCK-8法检测连续培养7d肝细胞的细胞活力；全自动生化分析仪检测成人原代肝细胞在培养过程的白蛋白、

5、尿素合成及相关生化功能指标；应用蛋白质印迹法（WesternBlot）检测体外培养肝细胞细胞色素P450表达（生物转化反应第一相反应）。结果：91.新鲜分离的成人原代肝细胞数目大于10个，台盼蓝拒染法检测肝细胞活率达90%或以上。2.培养24小时后，肝细胞PAS糖原染色发现成人原代肝细胞内糖原被染成红色颗粒或片状，抗细胞角蛋白CK-18免疫组织化学染色发现CK-18在肝细胞内均匀分布，被染成棕黄色；糖原染色及细胞角蛋白CK-18联合鉴定肝细胞纯度达95%以上。3.CCK-8实验结果显示肝细胞培养第三天细胞活力处于最佳状态。4

6、.培养的1周的过程中，肝细胞均具有良好的合成糖原、白蛋白I和尿素的功能。5.培养过程中，ALT、AST、LDH的泄漏率呈下降后上升的趋势，在培养3天时达到最低，培养4天时开始上升，白蛋白的分泌量和尿素合成量在培养3天时达到最高，培养4天时开始下降。6.在离体培养1-7天中，肝细胞在80KD处均可见有细胞色素P450表达，并且在第3天表达最好。结论：1.改良胶原酶灌注分离法分离肝细胞操作步骤简单，得到的肝细胞数目多、纯度高且具有完善的细胞功能。2.本研究所示肝细胞的细胞活力及细胞的生化性质均在培养的第3天时达到最好的状态。3.

7、在离体培养1周的过程中，成人原代肝细胞均具有很好的细胞色素P450表达功能，且在第3天表达最好。关键词：成人原代肝细胞；鉴定；P450表达IIIsolation、identificationandtheproteinsynthesisofadultprimaryhepatocyte,andtheexpressionofP450AbstractObjective:Toexplorethehepatocyteisolationandtheidentificationtechnologyofadultbenignlesionsof

8、liverresectionoperationofleaves,Tostudythechangesofcellviabilityinthecultureprocessofadultprimaryhepatocyte,andtheChangesinproteinsynthesisandcyt