mir-138通过hif-1α在人和大鼠缺氧梗死心肌组织和细胞中的表达意义和作用机制

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1、密级——博士学位论文－ｍ１３８－ｉＲ通过Ｈ〖Ｆｌａ在人和大鼠缺氧梗死心肌獅细胞中的表达意义和作臟制作老姓名：张佐指导錄—繊学科专业：法医学大连医科大学中图分类号密级－－ａｍｉＲ１３８通过ＨＩＦｌ在人和大鼠缺氧梗死心肌组织和细胞中的表达意义和作用机制Ｅｘｒｅｓｓｏｎｓｎｍ－ｉｉｉｆｉｃａｎｃｅａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｉＲ１３８ｉｎｈｕｍａｎａｎｄｒａｔｐｇ－ｉｎｆａｒｃｔｅｄｍｙｏｃａｒｄｉａｌｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｈｙｐｏｘｉａｔｈｒｏｕｈＨＩＦｌａｇ

2、张俊计：学位论文：９６页表格：１５个插图：２９幅指导教师：李连宏教授：博士学位学科（专业）申请学位级别：法医学二〇一六年八培养单位：大连医科大学基础医学院完成时间：Ｊｊ答辩委员会主席独创性声晒本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在指导教师指导下进行的研究工作及所取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文屮不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同丄作的同忐对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学签位论

3、文作者签名：字ｎ期：■＞／／年＂月／／１１目录一、摘要1（一）中文摘要1（二）英文摘要6二、正文12第一部分miR-138与HIF-1α在人心肌梗死组织中的表达意义及相关性分析（一）前言12（二）材料与方法141.材料141.1标本141.2主要试剂151.3主要实验仪器及器材152.免疫组织化学染色（S-P法）163.石蜡包埋心肌组织中提取microRNA163.1实验材料的处理163.2microRNA的提取173.3Taqman探针法miRNAqRT-PCR174.结果判定194.1结果判定标准194.2实时定量PCR测定miR-138的结果195.统计学分析

4、19（三）结果201.HIF-1α在早、晚期缺氧猝死组和正常心肌组的表达202.Sca-1在早、晚期缺氧猝死组和正常心肌组的表达203.Notch1在早、晚期缺氧猝死组和正常心肌组的表达214.CTGF在早、晚期缺氧猝死组和正常心肌组的表达215.HIF-1α与Sca-1、Notch1、CTGF在各组中表达的相关性分析226.miR-138、HIF-1α在各组心肌组织中的表达分析23（四）讨论23（五）结论27（六）参考文献28第二部分构建携带大鼠miR-138基因及慢病毒载体，稳定转染大鼠心肌细胞H9C2的研究（一）前言35（二）材料与方法351.细胞株352.主要试剂36

5、3.主要仪器设备364.质粒选择375.PBS液配制376.DMEM/F12培养基的配制377.MTT配制388.DMSO细胞冻存液的配制389.0.25%胰蛋白酶消化液的配制3810.主要的细胞培养技术3811.miR-138真核表达质粒的构建及鉴定3912.慢病毒载体的构建4213.统计学分析44（三）结果441.从H9C2细胞基因组中提取的Pre-miR-138DNA片段的PCR结果442.重组质粒pEGFP-miR-138的双酶切鉴定453.重组质粒pEGFP-miR-138的测序鉴定454.荧光倒置显微镜下观察荧光蛋白的表达情况465.荧光实时定量PCR检测转染H9

6、C2细胞后miR-138的表达46（四）讨论47（五）结论49（六）参考文献50第三部分miR-138与HIF-1α靶向关系的研究（一）前言53（二）材料与方法531.材料531.1主要试剂531.2实验仪器551.3主要试剂551.4RNA提取及实时定量PCR反应571.5荧光素酶表达报告质粒的构建581.6双荧光素酶实验591.7pMIR-HIF-1α-ORF1突变质粒的双荧光素酶实验601.8HIF-1α强制表达实验611.9Westernblot实验622.统计学分析63（三）结果631.miR-138的IE基因预测结果632.HIF-1α3'-UTR-pCHECK-

7、2、HIF-1αMut3'-UTR-pCHECK-2载体构建结果64（四）讨论65（五）结论67（六）参考文献68第四部分miR-138通过调节HIF-1α表达在心肌缺氧梗死后心肌重构的分子机制研究（一）前言70（二）材料与方法711.材料712.试剂配制723.缺氧细胞模型的建立724.统计学分析74（三）结果751.缺氧细胞模型的建立752.ROS含量的测定结果753.实时定量PRC结果754.流式细胞仪检测结果765.WesternBlot检测结果766.免疫荧光检测缺氧细胞内Sca-1蛋白水平的