stra8在精子发生中的表达研究

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1、＇‘‘＇户－、Ｖ＇Ｖ产賊；？．‘如‘美－ｙ＇於｛Ｖ＂ｗ．．Ｖ诸－分类号，学号Ｍ０５巧１２立＾Ｖ．Ｉ＇－ＵＤＣ密级户Ｖ々广１—＇＇！１觀Ｊ褲，賴／ＹＡＮＣＺＨＯＵＵＮＩＶＥ民別ＴＹ，．命ｆ戶，＂／ｙ．—硕去学位冷文三＃Ｖ．（学术型）冷、Ｙ韦‘．＼：Ｓｔｒａ８在精子发生中的表达硏究ｔ马仕昆指导教师姓名；王建军教授，郑英教授，扬州大学，江苏扬州，２２５００９人体解剖与组织胚胎学申请学位级别：硕壬学科专业名称；．．２０１５．０５．２７：２０１５０４１０

2、论文答辩日期：论文提交日期．．学仿巧予单化；２０１５０６３０＝扬州大学学位授予日期＇＇＇答辩委员会主席；巢国祥主任医师ｖｊＩ－．：；Ｍ，＇‘＇＾．；．＇：ｊｊ‘Ｉ、’三＇．－Ｊ六若＇‘Ｗ心Ｊ．叩’’？．．、Ｖ早謡年０６月Ｖ’护氣身．峨擊１致，．，’期吩、＾‘、ｍ戒ｒＳｔｒａ８在精子发生中的表达研究ＥｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳｔｒａＳｉｎｓｐｅｒｍａｌ；ｏｇｅｎｓｉｓｐ基金项目；国家自然科学基金（Ｎ０．３１３７１１７４）江苏省自然科学基金（ＢＫ２０１３１２３０）扬

3、州市社会发展科技攻关计划（２０１２１２７）扬州大学大学生科技创新项目扬州大学２０１５年０６月马仕昆巧ｔｒａ８在精子发生中的表达研究１Ｓｔｍ８在精子发生中的表达研究专业：人体解剖与组织脏胎学研究生：马仕昆导师；王建军教授郑英教授扬州大学中文摘要维生素Ａ通过其代谢产物视黄酸（ｒｅｔｉｎｏｉｃａｃｉｄ，ＲＡ）在精子发生过程中发挥重要的一种能够被ＲＡ特异性诱导活化的基因作用。Ｓｔｒａ８（ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｂｙｒｅｔｉｎｏｉｃａｃｉｄｅｎｅ）是，ｇ其表达具有发育阶段性，且在生殖腺中特异表达。Ｓｔｒ

4、ａ８基因敲除雄性小鼠不育，但其在精子发生中的作用机制尚未阐明。本课题从Ｓｔｒａ８多克隆抗体的制各、Ｓｔｒａ８过表达细胞株的构建及Ｓｔｒａ８在不同模型小鼠睾丸组织中的表达Ｈ个方面初步探索了Ｓｔｒａ８．在精子发生中的表达情况，为深入研究Ｓｔｒａ８在精子发生中的作用机制奠定了基础。一第，进行了Ｓｔｒａ８原核蛋白的表么应用纯化的Ｓｔｒａ８蛋白免疫小鼠，获得了特异性Ｓｔｒａ８多克隆抗体。首先通过ＰＣＲ扩增，获得Ｓｔｒａ８开放阅读框全长基因片段，应用分子克隆的方法插入ＥＴ２＋中Ｓ－到原核蛋白表达载体ｐ８ａ，构建了ｔｒａ８原核表达载体ｐＥＴ２

5、８ａＳｔｒａ８。将其转化到大ｋ－麻杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｉｓ后，用ＩＰＴＧ诱导Ｓｔｒａ８原核蛋白表达，ＨｉｓＴａｇ柱亲和层析纯化Ｓ８ＢＢＣ蛋白，透析复化用复性后的ｔｒａ蛋白为抗原，腹腔注射免疫ａｌ／小鼠，获得了小鼠Ｓｔｒａ８多克隆抗体，并分别用ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ及免疫巧光检测法证实所得到的多克隆抗体能够特异性识别Ｓｔｒａ８。第二，应用慢病毒表达系统，构建了稳定过表达Ｓｔｒａ８的小鼠精原细胞株。将Ｓｔｒａ８开放阅读框全长基因片段插入慢病毒载体ＧＶ３４１中，构建了慢病毒重组表达－－载体ＧＶ３４１Ｓｔｒａ８。然后将ＧＶ

6、３４１Ｓｔｒａ８及两种辅助包装质粒共转染至２９３Ｔ细胞中，收集，用浓缩后的慢病毒上清感染小鼠精原细胞系细胞含慢病毒颗粒的上清，经囑岭霉素筛选后，获得了稳定过表达Ｓｔｒａ８的小鼠精原细胞株。应用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ及免疫巧光检测法对细胞进行Ｓｔｒａ８过表达的鉴定，结果发现，构建的细胞株能表达大量的Ｓｔｒａ８蛋白，且Ｓｔｒａ８蛋白同时表达于细胞质和细胞核中，Ｗ细胞质中表达居多。第三成功制备了维生素Ａ缺乏（ｖｉｔａｍｉｎＡｄｅｆｉｃｉｅｎｔＶＡＤ）雄性小鼠及ＶＡＤ恢，复雄Ｉ扬州大学硕±学位论文性小鼠模型，应用免疫萊光技术分析了

7、Ｓｔｒａ８在不同模型小鼠睾丸组织中的表达情况。用ＶＡＤ饲料喂养雌雄性小鼠两周后合笼３－１４，新生雄性小鼠ＶＡＤ饲料喂养１周后获得ＶＡＤ小鼠。取１００天左右ＶＡＤ小鼠，给予维生素Ａ正常的饮食，维持３５天Ｗ上即可获得ＶＡＤ恢复模型小鼠。应用ＨＥ染色法对睾丸姐织进行形态学分析。在此基础上选取模型小鼠不同时期睾丸組织，通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ、免疫巧光化学等方法研究Ｓｔｒａ８的表达情况。结果发现，ＶＡＤ小鼠从ＶＡＤ饮食第８１天起部分生精小管即开始出现生精奈乱，到１００天时，生精小管中仅有支持细胞和少量精原细胞。ＶＡＤ小鼠恢复正常饮食后第９天

8、起，生精小管中初级精