基因芯片技术及临床应用

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1、基因芯片技术及临床应用府伟灵西南医院检验科一.概述随着人类基因组测序计划的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列得到测定。在GenBank数据库中已含有300万个序列，总数超过22亿个碱基对，其中包括19种不同生物体的完整序列、近9000个已知功能或已推测功能的人类基因序列。基因序列数据库正在以前所未有的速度迅速增长。2然而如何充分利用新序列信息资源，怎样去研究如此众多基因的生物信息及其在生命过程中所担负的功能，成为生命科学工作者的共同课题。3已建立的诸如Northern印迹、RNA酶保护实验、S1核酸酶分析、噬斑杂交以及狭线

2、印迹等方法不能提供足够通量来有效地利用新的基因组学的资源。为此，必须发展高通量或平行监测基因表达的新方法。基因芯片技术正是在这样的背景下应运而生。4早在80年代初期，有人就曾设想利用计算机半导体技术生产基因芯片以对人类基因大量的遗传信息进行分析和检查。5但直到1994年Pease等人创造的光导原位合成高密、微化的寡核苷酸阵列(ODTA)的制作技术问世之后，才使该设想逐步成为现实。因此可以说光导ODTA化学合成法，为基因芯片技术奠定了基础。6现在全世界已有十多家公司从事基因芯片研究和开发工作，而且已有较为成型的产品和设备问世。这些公司主要以美国的Affymetrix

3、公司为代表。图片来自益来基因网:http://www.el-gene.com/美国“Fortune”杂志在1997年3月对基因芯片技术未来产业化的前景进行了重点介绍。7二.基因芯片的定义又称DNA芯片，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息。8三.基因芯片相关技术及其进展基因芯片制备技术靶基因的制备杂交和检测基因芯片设计杂交图像分析……PCR扩增靶基因标记原

4、位合成合成点样芯片杂交杂交检测数据分析实际应用提出问题芯片设计芯片制作试样处理表达差异分析多态性分析再测序生物信息学数学优化数据库标准化9101.基因芯片的主要类型基因芯片视分类方法不同可分为不同类型探针阵列形式原位合成合成点样光引导聚合法喷墨打印合成法（压电打印法）片基或支持物无机芯片有机合成物芯片11基因芯片的主要类型及其简要特点122.基因芯片的制备基因芯片的实质是高度集成的寡核苷酸阵列制造基因芯片首先要解决的技术问题就是如何在芯片片基上定位合成高密度的核酸探针13原位合成直接在芯片上用四种核苷酸合成所需的探针合成点样将已经合成好的探针定位在芯片上基因芯片制

5、备的两种基本方法14原位光刻合成由美国Affymetrix公司开发AffymetrixWebsite:http://www.affymetrix.com/PicturefromUKBF:http://www.ukbf.fu-berlin.de/15把玻璃基片上的活性羟基修饰上光保护基团，此光保护基团可被一定波长的光激活并脱保护。根据所要制作的阵列的需要设计光刻掩膜。将掩膜（M1）覆盖在修饰过的基片上，用光照射使曝光区域的基片表面脱除保护基团而形成活性羟基（1-2）。步骤16引入5`端被X基团保护、3`端被活化的单核苷酸dNTP，使dNTP的3`端与基片上的活性羟基

6、缩合，洗去未有效结合的dNTP（3）。更换掩膜M2，重复1-2，直到所需要的探针阵列合成完毕（4-6）。17使用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列，在合成循环中探针数目呈指数增长。某一含ｎ个核苷酸的寡聚核苷酸，通过4×n个化学步骤能合成出4n个可能结构。例如：一个完整的十核苷酸通过32个化学步骤，8个小时可能合成65,536（即216）个探针。PictureFromBROWNLABhttp://cmgm.stanford.edu/pbrown/18原位喷印合成芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不

7、是碳粉。采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致，因此不需要特殊制备的化学试剂。PicturefromBioDot:http://www.biodot.com19分子印章多次压印合成法根据所需微阵列，设计有凹凸的微印章，然后根据预先设计在制备的各级印章上涂上对应的单核苷酸。按照设计的顺序将不同的微印章逐个依次压印在同一基片上，得到256×256阵列的高密度基因芯片。图片来自益来基因网:http://www.el-gene.com/20256*256分子印章阵列显微图 （0.18%)高密度芯片DNA阵列显微图（0.16%）高密度芯片DNA阵列荧光杂交图（0.09%）

8、图片来自益