异丁醇细胞工厂的构建和优化

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1、密级：中国科学院大学UniversityofChineseAcademyofSciences博士学位论文培养单位：二零一三年四月MetabolicEngineeringofEscherichiaColiforIsobutanolProductionByAiqinShiADissertationSubmittedtoUniversityofChineseAcademyofSciencesInpartialfulfillmentoftherequirementForthedegreeofDoctorofMicrobiologyTianjin

2、InstituteofIndustrialBiotechnology，ChineseAcademyofSciencesApril，2013独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。作者签名：名磕琴日期：矽序年r月l7日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解虫冒型堂睦云望王!蛙堑堇盎叠塞压有关保留、使用学位论

3、文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权虫国科堂院云望』些生堑撞苤硒塞所可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同意中国科学院天津工业生物技术研究所可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。作者签名：届爱鸯导师签名：弘写砜．／日期：功f芎年r月一日日期：ⅪJ亏年3月‘／日j

4、致谢三年的博士生学习生活即将结束。回首这短暂的求学经历，感慨颇多。在这三年中，很多老师、同学和朋友在各方面给予了我大力

5、的支持和帮助，值此论文完成之际，谨向他们表示最诚挚的谢意。首先，本论文是在导师张学礼研究员的悉心指导下完成的。张老师渊博的学识、活跃的思维、严谨的治学态度、循循善诱的教导使我终生受益；他给我提供了宝贵的学习机会，让我度过了美好而充实的研究生生活，值此论文完成之际，谨在此表达我最诚挚的感谢和敬意!在三年的研究生生活中，有幸在中国科学院天津工业生物技术研究所学习，衷心感谢研究所的领导和各位老师对我的栽培和厚爱。本文是在张学礼老师领导的微生物代谢工程实验室完成的，特别感谢陈卓、朱欣娜、徐洪涛、戴住波、李清艳和刘萍萍对本实验论文的耐心指导和深切

6、关注!感谢我的室友蔡鹏丽，还有一起工作学习过的同学韩丽、高秀珍和李广悦，在我生活和工作上的帮助和支持。感谢我可爱的师弟师妹们，他们是谭在高、刘怡、赵婧、唐金磊、许骄阳、肖梦雍、陈晶、戴冠平、王贝贝、王晓芳、施明雨、孙涛、李阳和刘芸，是他们共同营造了愉快的学习氛围和进取的工作气息伴随我度过了美好的研究生生活。感谢我的家人，他们共同分享了我的快乐和痛苦，一直默默地帮助、支持和鼓励我，使我有决心和信心完成学业。大家的帮助使我顺利完成了论文，在此表示衷心感谢!石爱琴2013年4月摘要随着环境污染不断加重以及能源供求之间的矛盾日益尖锐，寻找石化燃

7、料的可替代生物能源越来越受到人们的关注。异丁醇由于具有能量密度接近于汽油：气压低，容易与汽油混合；与乙醇相比，可以和汽油高比例混合，而不需要特殊的适应装置等优势而受到人们的青睐。利用支链氨基酸合成途径和Ehrlich途径已经在几种生物中实现了异丁醇的生物合成。本研究将异丁醇合成途径中的五个关键基因(alsS，ilvC，ilvD，kivD及adhA)整合到大肠杆菌XZ—T010基因组上，并利用本实验室构建的人工调控元件对其表达进行优化，获得一个性能较好的异丁醇生产茵ASl08，好氧发酵24小时生产l14mM异丁醇，糖醇转化率为O．51mo

8、l／mol，厌氧发酵6天生产35mM异丁醇，糖醇转化率为0．66mol／mol。之后采用RBS文库在菌株ASl08中对异丁醇生物合成基因进行调控并进行酶活测定，发现对醇脱氢酶AdhP进行调控优化后，异丁醇产量提高了20％，转化率提高了9％，醇脱氢酶的酶活提高了18％。异丁醇生物合成过程中需要还原性辅因子NADPH，而厌氧条件下，糖醇解过程中主要生产NADH。本研究采用三种不同的策略来优化胞内辅因子供求之间的平衡以满足异丁醇生产的需要。第一种策略是通过激活转氢酶和NAD激酶，加速NADH和NADPH之间的转换。在厌氧发酵条件下，只激活转氢

9、酶导致异丁醇产量增加了20％，转化率增加了8％。虽然进行NAD激酶单基因调控对异丁醇的生产没有效果，但是将NAD激酶和转氢酶一起激活之后，与只进行转氢酶调控的菌株相比，异丁醇产量提高50％，转化率提高30％