麂亚科动物的亲缘关系和hsBLyS的真核表达

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1、南京师范大学硕士学位论文麂亚科动物的亲缘关系和hsBLyS的真核表达姓名：戴君勇申请学位级别：硕士专业：细胞生物学指导教师：曹祥荣2003.5.1声明本人郑重声明：1、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。2、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果。3、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。4、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。5、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了谢意。作者签名：日期：堡圭焦塞

2、夔塑：羔堕型幽塑鲤业坐坐丛墨姿．摘要／麂亚科(Mu月砌cinae)动物属鹿科(Cervidae)，包括麂属(Muntiacus)和毛冠鹿属(Elaphodus)，具有令人瞩目的细胞遗传学特性。目前已知的该类动物的染色体数目从2n=6～48不等，而且出现种内核型多态，是研究动物进化的理想材料。场了探讨麂亚科动物间的亲缘关系，本论文以赤麂(／guntiacusmuntjak)、黑麂(Muntiacuscrinifrons)、小麂(Muntiacusreevesi)和毛冠鹿(E]aphoduscephal

3、ophus)这4种麂亚科动物为材料，以核基因序列为研究对象，作进一步的研究。我们提取了动物的基因组DNA。根据人的GAPDH基因和毛冠鹿的钾通道基因设计引物。以基因组DNA为模板，进行PCR扩增。扩增GAPDH基因片段的大小约为300bp，扩增钾通道基因片段的大小约为940bp。将获得的目的条带割胶、回收和纯化。采用T-A互补克隆法，将纯化后的扩增产物克隆到质粒pMD18一TVector中，转化DH一5o菌，菌落PCR鉴定并挑选阳性克隆，用M13-47／RV—M通用引物进行测序。测序的结果经clus

4、talw软件进行同源性比较。说明基因序列能够与形态分类学结沦一致。麂属动物之剧的序列差异为O％~1．5％，毛冠鹿属与麂属之间的序列差异为1．5％--2．O％。对所得的基因序列用MEGA软件包进行系统进化分析，NJ法和最大简约法(MP)构建毛冠鹿和麂属3种动物的分子系统进化树。触果表明，GAI，DH是一个古老的核基因，管家基因，又是～个功能基因，是十分保守的基因。对于距现今较近的动物，用其作为近亲缘关系的属内种间的标记基因，可能产生偏差。根据钾离子通道蛋白基因的第4内含子和第5外显子序列构建的进化树显

5、示：黑麂比较原始，首先与赤麂聚合，再与小麂聚合，最后与毛冠鹿属的毛冠鹿聚合。尤其当我们把钾通道蛋白基因的内含子单独构建进化树时，更能真实地反映麂亚科动物间的进化关系。这也说明，当我们对近亲缘关系的物种进行分子进化分析时，应选择核苷酸序列变化较快的线粒体或相应基因的内含予进行分析，更能够把其相互之间的进化关系准确地表现出来。J此外，用构建的融合表达载体pcDNA3．1(+)／hsBLyS转染真核宿主细胞COS一7，然后在合适的培养条件下进行表达，取不同表达时间(48h、72h和96h)的细胞破碎后进行

6、分析鉴定，找出最合适的表达时间及其他条件。f结果表明，采(2用COS．7作为真核表达细胞株，其表达目的蛋白的最佳时间是72小时。而且由本实验结果看，用磷酸钙法转染!田里的转染效率明显比脂质体法高。扣关键词：麂亚科，系统进做GAPDI絮钾离子通道蛋白基因，、内含子?hsBLyS。堡圭丝塞堕茎曼三一型垩型垫塑堕童丝苤墨墨上星生垒堕舅咝Abstract^缸门f胁c加口PincludeMuntiacusandElaphodus,theybelongtoCervidaeManyresearcherspayat

7、tentiontOthecytogeneticscharacteroftheseanimals·Recently，weknowthenumberofmuntjacdeerchromosomesvariesfrom6to48，andtherearekaryotypicpolymorphismintra—speciesrelationships．Theseanimalsareextremelyusefulforphylogeneticstudies．Inordertodiscussthephylogen

8、eticrelationshipsofA缸盯f妇cf玎口它，wehavestudiedthenucleargenesequenceofMuntiacusmuntjak,Muntiacuscrinifrons，Muntiacusreevesi，andElaphoduscephalophus．WeisolatedgenomicDNAfromthefouranimals，WedesignedandsynthesizedtheprimersofthehumanGAPDHgen