HIV1+P24病毒载量试剂盒的研发

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1、摘要II一一一II一．I皇曼!曼鼍皇曼!!曼曼!!!曼曼曼曼曼获得性免疫缺陷综合征，简称艾滋病(acquiredjmmunodenciencysyndrome，AIDS)，是由免疫缺陷病毒(humanimmunodenciencyvirus，HIV)感染所引起的一种严重的传染性疾病。自从美国于1981年首次发现并定名以来，艾滋病以惊人的速度在全球传播。其流行规模之大，罹患人数之多，造成人类生命与社会经济损失之大均已超过历史上任何一种传染病。目前我国的艾滋病疫情仍呈上升趋势，发病和死亡依然严重，存在疫情进一步蔓延的危险。

2、P24是病毒颗粒的主要结构蛋白，在病毒的包装和成熟过程中起重要用。目前，P24抗原检测在以下几方面都有重要应用：HIV-1窗口期的辅助诊断；HIV-I抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助鉴别诊断；第四代HIV-1抗原／抗体ELISA试剂检测的辅助诊断：监测病程进展和抗病毒治疗效果。对HIV感染者进行HARRT治疗时检测患者体内的病毒载量是评价治疗效果的有效手段。RNA病毒载量检测法是目前较为敏感、应用较为广泛的方法。但现有的RNA病毒载量检测方法的检测仪器、检测试剂价格昂贵，且操作复杂，难以在一般实验室推广，也不适合广泛的临

3、床应用。因此，价格相对便宜，操作简单的高灵敏度P24抗原检测方法的建立成为在发展中国家进行HIV病毒载量测定一种选择。本文以研制出高质量的HIV-1P24诊断用抗原、单抗、多抗，制备HIV-1P24病毒载量测定试剂盒为目的，包括以下几个方面：1、HIVAlP24抗原的表达和纯化：用套式多聚酶链式反应(nested．PCR)扩增HIV诅lP24全长基因，并在基因上下游引入了酶切位点；然后P24基因插入到原核表达载体pTXBl中，构建原核表达质粒。该表达载体在大肠杆菌BL21中能够高效表达，使用破菌、几丁质亲和层析等步骤纯

4、化P24抗原，纯化效果大于95％。2、HIV-lP24单克隆抗体的制备与纯化：用本科室保存的HIV-B亚型P24抗原免疫小鼠，用ELISA方法检测小鼠的体液免疫反应。最后一次免疫后一周，取小鼠脾细胞与sp2／0细胞进行融合，制备杂交瘤细胞。用有限稀释法并结合药物筛选的方法对细胞进行筛选，最终筛选到4株能够分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。将筛选到的细胞分别放大培养，并收获大量含有P24单抗的细胞上清。利用饱和硫酸铵沉淀法、蛋白G亲和层析的方法纯化P24抗原。3、HIV-1P24多克隆抗体的制备与纯化：用本科室保存的HIV-B

5、亚型P24抗原免疫兔子，用ELISA方法检测兔子的体液免疫反应。最后一次免疫后一周，采用颈动脉采血法，获得大量含有P24多克隆抗体的兔血清，经多次正辛酸-饱III北京工业大学理学硕士学位论文和硫酸铵沉淀法对收获的P24兔多抗进行了纯化。最后用生物素对兔多抗进行了标记。4、HIV-1P24病毒载量测定试剂盒的初步建立和考核：使用本研究中制备的P24单克隆抗体、P24多克隆抗体，制备了HIV-1P24病毒载量测定试剂盒，同时建立了试剂盒的标准步骤、P24抗原标准品和溶液体系(包括包被液、封闭液、稀释液、洗液)。最后对试剂盒

6、的灵敏性和稳定性方面进行了初步考核。其最低检出浓度可达72pg／ml。关键词：HIV-1：P24抗体；P24抗原；病毒载量；试剂盒IVABSTRACTIIIIt一__-．一II一一I鼍Acquiredimmunodefjciencysyndrome(AIDS)isaseriousdiseaseresultingfromHIVinfection．AIDSspreadthroughouttheworldatanalarmingratesinceHIVwasfirstlyfoundandnamedintheUnitedSta

7、tesin1981．Morever，thescaleofAIDS’Sepidemic，theriumberofpatients，thelossesofhumanlifeandsocio—economicweremorethananyotherinfectiousdiseasesinthehistory．Atpresent，theHIV／AIDSepidemicsituationisstillrisinginChina．Tillnow，themortalityandmorbidityofAIDSarestillhigha

8、ndtheepidemicmaybespreadinthelongrun．P24isamajorvirionstructuralproteinandplaysanimportantroleinvirus’packagingandmaturationprocess．P24antigentesthasimportantapplicat