鸡MHCⅡαβ链基因的克隆和原核表达及其抗体制备

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1、中文捅蔓主要组织相容性复合体(Majorhistocompatibilitycomplex，MHC)是由紧密连锁的高度多态的基因位点所组成的位于染色体上一个遗传区域，广泛存在于所有脊椎动物，具有高度的多态性和保守性。该基因区编码的蛋白通常称为MHC分子或MHC抗原，是移植物排斥的主要决定簇。根据结构和功能可将MHC分为I、II、III三类。其中，MHCII类分子是由2条非共价结合的多肽链(o【链和B链)构成的糖蛋白，它们由不同的MHC基因编码。c【链(32000～34000)比B链(29000～32000)略大，2条链均含有寡

2、糖，旺链糖基化程度较高。结构上I类分子和II类分子均可分成肽结合区、Ig样区、跨膜区和胞浆区4个部位。MHCII类分子选择性地分布于有免疫功能的细胞如B细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、激活的T细胞等细胞膜上。MHC的主要功能是递呈抗原肽段，通过MHC．抗原肽复合物活化、诱导T细胞和B细胞的免疫应答。MHCII类分子递呈的抗原主要是外源性抗原。为了探索鸡MHcII类分子在免疫应答中的作用及其机理，本研究运用分子生物学技术，进行了克隆、表达和鉴定。首先，根据GenBank中登录的鸡类MHCII的o【链和D链基因序列与载体DG

3、Ex-4T-1的多克隆酶切位点分别设计两对引物，利用反转录一聚合酶链式反应(RT．PCR)从有丝分裂原刀豆蛋白A(ConA)刺激18h活化的鸡脾淋巴细胞中扩增出相应大小的a链(77lbp)和D链(798bp)的基因；经酶切鉴定，所扩增的a链和§链基因片段含有相应的酶切位点：然后将这两个片段分别插入载体pGEX．4T．1中，并转化宿主菌BL21，经双酶切鉴定重组质粒pGEX一4T一1／a和pGEX-4T-1／13后，对Ⅱ链和D链的核苷酸序列进行测定。结果表明本研究成功地克隆了鸡MHCII的a链和B链基因，它们分别编码771和79

4、8个核苷酸。与GeneBank登录的仪链基因(登录号：AY357254)相比较，只有四个核苷酸的差异，同源性为99％，导致2个氨基酸的改变。同样，与GeneBank登录的B链基因(登录号：$66480)相比较，有42个核苷酸的差异，同源性为95％，导致27个氨基酸的改变。其次，将上述构建成功的原核表达重组质粒pGEX．4T一1／IXSfnpGEX．4T一1／B，转化大肠杆菌BL21，经异丙基一B-D一硫代半乳糖苷(IPTG)于37℃诱导培养4h，表达出含有谷胱甘肽一S一转移酶(GST)的融合蛋白GST—d和GST—p；对表达条

5、件进行相应的优化，确定了最佳诱导表达时间和诱导剂浓度；对表达蛋白的可溶性进行鉴定，结果表明表达的融合蛋白GST．程和GST．p均以包涵体形式存在；利用优化的原核表达条件对含有质粒GST．0【和GST．D的BL21菌进行大量诱导表达，通过反复冻融和超声裂解诱导菌，获得浓度较高的GST—d和GST-p包涵体蛋白，用十二烷基肌氨酸钠加超声波的方法使包涵体充分溶解，溶解的包涵体通过谷胱甘肽琼脂糖亲和层析获得纯化的GST．a和GST—D融合蛋白。最后，利用上述纯化的GST—d和GST．B融合蛋白作为抗原分别免疫小鼠制备鼠抗鸡0【链和B链

6、多克隆抗体。琼脂扩散实验和ELISA实验表明制备的两种多抗均具有良好的抗原性。综上所述，本研究成功地克隆了鸡的II类MHC的cc链和D链基因，构建了原核表达质粒，并进行了原核蛋白表达和纯化，并制备了效价高、反应性和特异性强的鼠源抗鸡II类MHC的a链和D链多克隆抗体，为进一步研究鸡的II类MHC基因的免疫功能和生物学活性奠定了基础。关键词：鸡MHCIIa邝链克隆原核表达多抗制备AbstractThenlajorhistocompatibilitycomplex(MHC)isanextendedclusterofgeneswit

7、hextraordinarypOlymorphismandcompactlinkageinthechromosome，spreadingoverallvertebrates．MHCmoleculesarealsoconsideredastheprimarydeterminantsinthetransplantrejection．Accordingtotheirstructureandfunction，MHCmolecuIescouldbedividedintoclassI，IIandIII．ClassIImoleculesar

8、eglycoproteinsthatareformedbytwononcovalence—associatedchains，0【(32000～34000)andB(29000～32000)，eachofwhichisencodedbydifferentMHCgenes。Lik