DNA测序常见问题和其分析

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1、测序常见问题及其分析CollectedbyRobertoRun,12.10.2008(From:HTUTUhttp://biology.aweb.com.cn/news/2007/9/5/14270898.shtmlUUTTH)1、PCR产物测序时出现重叠峰　　问题图1（模板中有碱基缺失，往往是单一位点（1-1）或两个位点（1-2）碱基缺失导致测序结果移码）　　图1-1　　图1-2　　解决方法：将PCR产物克隆到质粒（如T载体）中挑单克隆测序，或将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。　　问题图2（PC

2、R产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一）　　图2　　解决方法：主要原因是PCR产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段，将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序，便可解决。　　问题图3（测序引物有碱基缺失）　　测序引物有碱基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的碱基缺失即图1有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。　　解决方法：重新合成引物，或将引物进行PAG

3、E纯化　　2、克隆测序时出现峰形重叠　　原因：所挑选的重组子不是单克隆，所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒；或是是送测序的菌液污染　　解决方法：重新挑单克隆的菌落（划线分离单菌落），提质粒或送菌液再次测序。　　3、样品有杂合/突变位点　　模板中有杂合型突变，也就说模板本身在这个位点出现突变；或者是从基因组中扩增出来的杂合位点。如果模板有杂合（突变或缺失），那么测序图形中其他的位點一般都是單一的峰形，然后突然在某一個位點出現重叠峰(如图中箭頭所示)。　　解决方法：建议将DNA片段克隆到载体再测序。　　4、polyA/T和C

4、/Gcluster导致的套峰和测序信号衰减　　图4-1　　图4-3　　图4-4　　RACE测序时经常遇到图4-1和图4-4的情形，解决方法：从另一端测序；但如果这样的序列出现在中间，呵呵，目前还没有很好的解决方法，要看测序公司的本事了。　　C/Gcluster在PrV基因组测序时遇到过。后来还是让TaKaRa公司给解决了，虽然不喜欢鬼子，但有时候却不得不用它们的产品和服务。　　5、基因中含有重复序列　　可能的原因:样品中含有重復序列导致的测序结果和PolyA/T的结果一样，会导致Frame滑动，较短的重復序列会导致测序结果出现移码；而较

5、长的重復序列会使定序信号衰减。解决办法:反向测序有时能够顺利的通过重復序列区域(但不是一定都能够)，通过多次的测序结果比对，拼接可以得到全序列结果。TT测序结果常见的几个问题TT(From:HTUTUhttp://www.shinegene.org.cn/service/serv003.htmlUUTTH)1、为什么开始一段序列的信号很杂乱，几乎难以辨别?这主要是因为残存的染料单体造成的干扰峰所致，该干扰峰和正常序列峰重叠在一起；另外，测序电泳开始阶段电压有一个稳定期，所以经常有20-50bp的紧接着引物的片段读不清楚，有时甚至更长。2

6、、为什么在序列的末端容易产生N值，峰图较杂?由于测序反应的信号是逐渐减弱的，所以序列末端的信号会很弱，峰图自然就会杂乱，加上测序胶的分辨率问题，如果碱基分不开，就会产生N值，正常情况下ABI377测序仪能正确读出500个碱基的有效序列。3、测序结果怎么找不到我的引物序列?如果找不到测序所用的引物序列。这是正常的，因为引物本身是不被标记的，所以在测序报告中是找不到的；如果找不到克隆片段中的扩增引物，可能是您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到扩增引物；另外插入片段的插入方向如果是反的，此

7、时需找引物的互补序列。4、测序结果怎么看不到我克隆的酶切位点?可能的原因同上，您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到酶切位点。通常我们会尽量选择距离酶切位点远点的引物，当然，若是样品出现意外原因，如空载、载体自连等，克隆的酶切位点也是看不到的。5、你测出的结果与我预想的不一致，给我的结果与我需要的序列有差距，这是怎么回事?首先，我们会核实给您的测序结果是否对应您的样品编号，如果对应的是您的样品，由于不知您的实验背景，测得的序列是否与您预想的结果一致我们无法判断，我们能做到的是检查发送给

8、您的测序结果和您提供来的样品是否一致。6、序列图为什么会有背景噪音(杂带)?是否会影响测序结果?序列图的背景杂带是由荧光染料引起，如果太强会影响测序结果，要看信噪比，我们给的结果信噪比大都在98%以上。7、