发酵工程在现代生物技术中的应用

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1、第八章发酵工程在现代生物技术中的应用第一节基因工程菌的发酵就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目标产物，工程菌和常规微生物并无太多的差异。但工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，以及安全性等问题，使得工程菌的培养有着自身所特有的特点。（一）工程菌的稳定性1、基因工程菌不稳定的表现生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生长得快得多，从而能替代有生产能力的菌株，这就导致基因的不稳定性。基因的不稳定性原因：质粒分离丢失、结构不稳定性表达产物

2、的不稳定性（宿主细胞调节突变）质粒丢失当细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就出现分离丢失。质粒可分为高拷贝质粒（>20拷贝/细胞）和低拷贝质粒（有时低到每个细胞一至二个拷贝）。低拷贝质粒有专门的机制保证在子代细胞中有相等的分配，高拷贝质粒通常很少遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质粒，几乎所有子细胞接受一些质粒，也有可能有的细胞没有接受质粒，当然形成无质粒细胞的可能性是低的（每百万细胞分裂中一个）。但在大的反应器中含有非常多的细胞，总会存在无质粒细胞，例如1000L发酵液，每毫升有109个细胞，总共就有1015个细胞，那么在这个

3、反应器中就含有109个无质粒细胞。质粒的分离丢失可能受许多环境因素影响，如溶氧、温度、培养基组成和恒化器中的稀释速率。许多质粒也会形成多聚体，它是相同质粒附着在一起形成一个单位。质粒结构不稳定性除了分离不稳定性问题外，某些细胞保留质粒，但质粒结构发生改变，而不产生外源蛋白，减少对细胞的有害影响，这就是结构不稳定性。如果质粒发生突变，仍保留了抗生素抗性基因，但不合成外源蛋白，那么这些突变株仍能在含有抗生素的培养基中生长。而且由于不合成外源蛋白，生长得比原来的工程菌更快，使得在这种培养物中带有改变了的质粒占统治地位的菌，这种培养情况

4、就是结构不稳定性。表达产物的不稳定性宿主细胞的突变也会造成生产能力的减少。这些突变通常改变细胞调节，结果减少目标蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表达的启动子，利用宿主细胞的启动子，如果宿主细胞启动子的改变，将大大改变质粒编码蛋白的生产水平。乳糖操纵子是常用是操纵子，通过加入乳糖或它的结构类似物（如IPTG）来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖苷透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的结构类似物进入细胞，从而不能启动细胞的表达。2、培养条件对工程菌稳定性的影响对于一个已经组建完成的工程菌来说，选择最适的培养条件是进行工业化生产的关键

5、步骤。在众多的环境因素中，培养基的组成、培养温度、菌体的比生长速率3个方面尤其重要。环境因素对质粒稳定性的影响机制错综复杂，许多尚属未知。1）培养基的组成2）菌体比生长速率比生长速率对重组质粒稳定性的影响结果不尽一致，并可能与克隆菌本身和培养条件有关。例如:在酵母系统中，大则质粒pJDB248稳定性高。如果不含重组质粒的宿主细胞不比含有重组质粒的工程菌生长快，则重组质粒的丢失也不会导致非常严重的后果；调整这两种菌的比生长速率可以提高重组质粒的稳定性。但很难达到3）培养温度通常，低温往往有利于重组质粒稳定地遗传。4）p

6、H和溶解氧pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对pH进行适当的调节溶解氧是工程菌发酵培养过程中影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产物的生成影响很大。外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的DO2值。通常采用调节搅拌转速的方法，可以改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量。4、控制基因过量表达提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产率，但外源基因表达水平越高，重组质粒往往越不稳定。可采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使重组质粒稳定地遗传；到后期通过提高

7、质粒的拷贝数或转录、翻译效率使外源基因高效表达。1）可诱导性启动子在构建表达载体时，可使用可诱导性的启动子，如：lac、trp、PL等在用含有这些启动子的克隆菌进行发酵生产时，可以选择培养条件使启动子受阻遏（抑制）到一定时期；然后去阻遏（诱导）使质粒高效表达。例如：利用3--吲哚乙酸可使trp启动子去阻遏2）温度敏感型质粒一些温度敏感型质粒在温度较低时质粒拷贝数较少，当温度升高到一定值时质粒大量扩增——脱缰质粒（runawayplasmid）如：pKN410在30℃时的拷贝数为20～50/E.coli细胞；在35℃时质粒

8、大量复制。将-内酰氨酶基因接在其上，经热诱导后，酶活可扩增400倍。5、施加选择压力从遗传学来说，选择意味着利用某些生长条件使得只有那些具有一定遗传特性的细胞才能够生长。1）抗生素添加法通常在重组质粒上含有抗药性基因AmpRAmpRTcR将含有抗药性基因的