实验四、细胞器分离、制备与观察

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1、实验4细胞器分离、制备与观察I线粒体制备与活性鉴定【目的】1．掌握分离制备动物和植物细胞线粒体的方法。2．对分离得到的线粒体进行活性鉴定。【原理】线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的，司能量转换的重要细胞器。细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过藕联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。将动植物组织制成匀浆，在适当的悬浮介质中用差速离心法可以分离细胞线粒体。在一定的离心场中(选用离心机的一定转速)，球心颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种

2、细胞器及其他内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器沉降先后顺序是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液，它较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性；pH7.2的条件下；亚细胞组分不容易重新聚集成团，有利于分离。整个操作过程样品要保持在0℃~4℃，避免酶失活。细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜组分和分离纯度的主要依据，如线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶，该酶使詹纳斯绿B染料保持在

3、氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。詹纳斯绿B是一种活体染料，能对动、植物的细胞或组织在活体状态下进行无毒害的染色。由于染料(碱性染料)的胶粒表面带有阳离子，酸性染料的胶粒表面带阴离子，而被染部分本身具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间发生吸引作用，染料就被堆集下来。染色法可以显示出活细胞内的某种天然结构存在的真实性，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以至引起细胞的死亡。鼠肝线粒体的分离【材料】鼠肝脏或猪肝脏。【实验用品】1．试剂：(1)0.25mol／L蔗糖+0.01mol／L三羟甲基氨基甲烷(Tri

4、s)一盐酸缓冲液(pH7.4)：0.1mol／L三羟甲基氨基甲烷溶液10mL0.1mol／L盐酸8.4mL加双蒸水到100mL，再加蔗糖使浓度为0.25mol／L。(2)0.34mol／L蔗糖+0.01mol／LTris一盐酸缓冲液(pH7.4)，配法同上。(3)1％詹纳斯绿B(JanusgreenB)染液，称取50mg詹纳斯绿B液溶于5mL生理盐水中，稍微加热使之溶解后，过滤，即为1％原液。(4)姬姆萨染液(Giemsa)：称取Giemsa粉0.5g、甘油33mL、纯甲醇33mL。先在Giemsa粉中加少量甘油，然后在研钵内研磨至无颗粒状，再

5、将剩余甘油倒入混匀，56℃左右保温2h，使其充分溶解，最后加甲醇混匀，成为Giemsa原液，保存于棕色瓶。使用时吸出少量用1／15mol／L磷酸缓冲液作10~20倍稀释。(5)1／15mol／L磷酸缓冲液(pH6.8)：1／15mol／L磷酸二氢钾(KH2PO4)50mL1／15mol／L磷酸氢二钠(Na2HPO4)50mL(6)卡诺(Cornay)固定液：无水乙醇6mL冰醋酸1mL氯仿3mL(7)生理盐水2．器具：解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃匀浆器，尼龙织物，刻度离心管，显微镜，冷冻高速离心机。【实验步骤】1．制备肝细胞匀浆：实验前将鼠空腹12小

6、时，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干水，称取肝组织2g，剪碎；用预冷的0.25mol／L蔗糖溶液洗涤数次。然后按每克肝加4.5mL预冷的0.25mol／L蔗糖溶液的量，分数次添加蔗糖溶液，在0~4℃冰浴中用玻璃匀浆器将肝制成匀浆，用双层纱布过滤。2．差速离心：将0.34mol／L蔗糖溶液4.5mL放入离心管，然后沿管壁小心地加入4.5mL鼠肝匀浆覆盖于上层。用冷冻控温的高速离心按下图顺序进行差速离心。分离细胞核：鼠肝匀浆700×g离心10min沉淀(细胞核及质膜碎片)上清液(1)洗涤(0.25mol／L预冷蔗糖溶液5mL洗

7、涤2次，每次1000×g离心15min。沉淀(细胞核及质膜碎片)上清液(2)→与上清(1)合并分离线粒体：混合上清液10000×g离心10min沉淀(线粒体)上清液(弃去)洗涤加预冷的0.25mol／L蔗糖溶液10mL，10000×g离心10min沉淀(纯化的线粒体)上清液(弃去)3．活性鉴定：(1)细胞核：取核沉淀1滴涂于载玻片，加入Carnoy固定液15min，晾干。Giemsa染液染10min，蒸馏水漂洗数秒，用滤纸吸干水、用显微镜(40×)检查，细胞核呈紫红色，混杂的胞质为浅蓝色碎片。(2)线粒体：取线粒体沉淀滴在载玻片上，勿太密。滴加

8、1％詹钠斯绿溶液染液，10min后用光学显微镜观察，线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。玉米线粒体的分离从植物细胞分离线粒体，除了作线粒体功能测定外，在植