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1、黑豆NBS类抗病基因同源片段克隆和研究摘要根据已克隆的抗病基因保守结构域设计简并引物，以湖南黑豆(HH)为试材，通过RT-PCR,从cDNA中扩增抗病基因同源序列，测序鉴定出2个含有通读阅读框的DNA片段：FNBS1、FNBS3oFNBS1大小为534bp,编码178个氨基酸；FNES3大小为513bp,编码169个氨基酸。BLASTP分析表明，2个片段均具有NB-ARC结构域(与植物抗病有关)，并且包含PToop、Kinase-2、HD等结构域。基因FNBS1与大豆基因RPMl-like编码的氨基酸序列的同源性为98%,基因FNBS3与大豆基因N-like编码的氨基酸
2、序列的同源性为99%,推测FNBS1、FNBS3可能是黑豆NBS-LRR类抗病基因的核心区域。关键词黑豆；NBS-LRR；抗病类基因；同源克隆；聚类分析中图分类号TS201文献标识码A文章编号1007-5739(2014)03-0009-03黑豆为豆科植物大豆［Glycinemax(L.)merr］的干燥种子，又称菜豆，是重要的农作物之一，与人们的生活息息相关。我国各地均有栽培，尤以山西、河北、陕西较多，资源优势明显。黑豆营养成分丰富，陈颖等［1］对黑豆的营养成分进行分析，发现黑豆不仅蛋白质含量高达45.70%,其亚油酸和亚麻酸的含量也相当高，不仅如此，黑豆维生素E的含
3、量为0.0219mg/g,抗氧化能力极强。丛建明［2］对黑豆营养成分分析研究发现，黑豆蛋白质含量高于40%,脂肪含量高达15.9%,脂肪酸主要成分为不饱和脂肪酸，微量元素及维生素含量丰富。黑豆除营养成分丰富以外，还含有花色昔等抗氧化剂和红色素等稳定性较好的色素，宋岩［3］对黑豆花色昔的研究发现，黑豆花色昔抗衰老作用明显，并且具有较强的抗氧化作用。近年来，还发现具有抗癌作用的黄酮类物质在黑豆中含量仅次于野生大豆［4］。黑豆医食价值优越，但是病虫害严重威胁黑豆的产量，而农药的使用会对生态环境造成威胁。因此，抗病品种的选育成为解决这一问题的重要途径。随着分子生物学的深入研究，
4、分离克隆黑豆抗病基因对了解病害的发生机制和植物抗病分子机理有着非常重要的作用。目前，科学工作研究者们相继克隆了香蕉、甘薯、大豆及辣椒等大量植物抗病基因及其同源序列［5-6］o根据目前已克隆的植物抗病基因保守结构域的特征，可分为四大类［7］,其中最大的一类为NBS-LRR类，NBS包含P-loop环、Kinase~2xKinase-3激酶结构域及HD疏水结构域。NBS类保守序列已被用于从不同植物基因组中发掘新的抗病基因，赵敬等从辣椒中分离出17个NBS-LRR类抗病基因同源序列，这些序列都含有NBS-LR类基因的6个保守结构域，其中基因CaRGAO1与来自番茄Solanu
5、mlycop-ersicum抗细菌性斑点病基因Bs4相似性为90%,基因CaRGA13与来自番茄Solanumsp.VFNT抗线虫基因Mi-1.4相似性为90%和91%,推测这2个序列可能是相关抗病基因的一部分或与相关抗病基因属于同一家族［8］。王海燕等利用已克隆的抗病基因NBS-LRR保守结构域设计引物，通过RT-PCR,获得了3条通读的NBS-LRR类抗病基因同源序列,Northern杂交分析表明,3个NBS-LRR类抗病基因同源序列在小麦的叶片中为低丰度组成型表达［9］,为从较为复杂的基因组中克隆出抗病基因打下了基础。王春玮［10］利用NBS-LRR基因家族的保守
6、序列设计引物，通过RACE-PCR获得了2个花生NBS-LRR类抗病基因的全长PnAGl-1和PnAGl-2,PnAGl-2全长1344bp,开放阅读框为1098bp,编码365个氨基酸。PnAGl-1全长1088bp,开放阅读框为741bp,编码247个氨基酸。黑豆为四倍体，其基因组比烟草、水稻等模式植物复杂，DNA及RNA提取难度大，因此目前尚未见从黑豆中克隆出NBS-LRR类抗病基因的报道［11］。笔者根据P-loop和HD2个保守结构域设计兼并引物，利用RT-PCR从湖南黑豆（HH）中克隆出4个抗病基因同源序列，其中2个片段可通读，并分析其与其他抗病基因和抗病基
7、因同源序列的关系，以期为黑豆NBS类抗病基因的克隆打下基础。1材料与方法1.1试验概况室内试验于2012年在福建农林大学生物楼进行。供试黑豆品种为湖南黑豆（HH）,由福建农林大学实验室提供。主要试剂及仪器：大肠杆菌DH5a由该实验室保存。PMD18-T载体、限制性内切酶、Taq酶、反转录试剂盒和胶回收试剂盒均购自TaKaRa公司；氨节青霉素（Amp）购自生物工程有限公司（Sangon）；进口电泳琼脂糖（Agarose）；其他试剂国产分析纯。PCR反应在eppendorf公司MastercyclerRPCR扩增仪上进行；琼脂糖凝胶电泳检测在
