中华绒螯蟹精子膜蛋白提取、抗体制备及其免疫定位研究

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1、密级:分类号:学校代码：10075学号：033703理学硕士学位论文中华绒螯蟹精子膜蛋白提取、体制备及其免疫定位研究学位申请人：王琦指导教师：康现江教授学位类别：理学硕士学科专业：生物化学与分子生物学授予单位：河北大学答辩日期：二oo六年六月CODE:10075NO:033703ClassifiedIndex:U.D.C:ADissertationfortheDegreeofM.ScienceExtraction,AntiseraPreparationandImmunolocalizationofSper

2、mMembraneProteinsinEriocheirsinensisCandidate:Supervisor:Specialty:AcademicDegreeAppliedfor:University:WangQiProf.KangXian-jiangBiochemistryandMolecularBiologyMasterofScienceHebeiUniversityDateofOralExamination:June,2006河北大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师

3、指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。作者签名：H期：年H日学位论文使用授权声明木人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复

4、制手段保存论文。木学位论文属于1、保密口，在年月日解密后适用木授权声明。2、不保密口。（请在以上相应方格内打“）作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月R摘要中华绒螯蟹(ENoche计sbzensis)是我国特有的水产珍品，也是我国一种重要的经济蟹类，广泛存在于我国南北各地淡水水域中。中华绒螯蟹是我国名优淡水养殖业的主要品种。近年来，其养殖业在沿海各地蓬勃兴起，它以优良的生物学品质，极高的营养价值和独特的风味蜚声海内外。养殖业的发展，进一步促进了基础科学研究的发展，而基础科学的发展，又反过來加速了养殖业

5、的蓬勃发展。本文就中华绒螯蟹精子膜蛋白提取、抗体制备及其免疫定位进行了研究，为其受精牛物学、发育生物学方面的深入研究提供参考资料。主要从以下几个方面进行了研究：1.对中华绒螯蟹雄性生殖系统进行解剖，得到贮精囊，进而分离到精荚，利用玻璃匀浆器匀浆的方法，对中华绒螯蟹精荚进行破碎，得到精荚基质和精子；使用两种去污剂对屮华绒螯蟹精子膜蛋白进行了提取，在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)条件下，对其精子膜蛋白组分进行了分析，实验结果表明，在双去污剂作用下，提取得到的精子膜蛋白与脱膜精子部分蛋白谱带差异明显

6、；并对提取的精子膜蛋白进行了分子量、等电点和糖蛋白检测，结果显示，所提取的12种精子膜蛋白，其分子量均在lOOku以下，等电点范围在4A-6.2之间，并均为糖蛋口，说明所提取的中华绒螯蟹精子膜蛋A是低分子量的酸性糖蛋A,这与其他一些哺乳动物精子膜蛋A的研究结果类似；2.乳酸脱氢酶(LDH)尤其是精子特异性乳酸脱氢酶，定位于膜上，也为精子膜蛋白的一种。利用天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native.PAGE)和特异性染色的方法，对中华绒螯蟹进行了乳酸脱氢酶同工酶电泳分析，实验结果表明，以两种不同底物(乳酸钠和a男

7、基丁酸钠)分别作用于血清、鲍、心脏、肌肉、肝胰腺、成熟蟹精巢、未成熟蟹精巢和精子，实验结果显示，乳酸脫氢酶同工酶具有组织特异性，并且首次在屮华绒螯蟹体内发现了精子特异性乳酸脫氢酶，这种酶在中华绒螯蟹精子成熟过程中均存在，并随着精子的成熟，其含量和酶活性逐渐增强，可能在精子成熟过程中起作用；3.利用抽提的精子膜蛋白免疫雌性新西兰白兔，制备多克隆抗血清；利用琼脂糖双向免疫扩散分别对多克隆抗血清活性、效价进行了分析，实验结果表明，制备的多克隆抗血清发生抗原抗体沉淀反应，具有免疫活性，且其效价为1:16；在精子膜

8、蛋白雌雄组织特异性检测中，其实验结果表明，制备的多克隆抗血清与精巢、输精管和贮精囊粗提液发生了明显的免疫沉淀反应，却与雌蟹血清未见有免疫沉淀作用，说明在雄性生殖系统各组织中（精巢、输精管和贮精囊）存在精子膜蛋白，而在雌蟹血清中不含有精子膜蛋白；乂对雄蟹不同组织（肝胰腺、心脏、肌肉和血清）进行了组织特异性分析，实验结果表明，制备的多克隆抗血清是组织特界性的；利用免疫印迹法对制备的多克隆抗血清进行了免疫原性分析，实验结果表明，在1