大白菜游离小孢子培养探究进展

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1、大白菜游离小胞子培养探究进展摘要：综述了国内外大白菜游离小胞子培养的最新研究成果。重点讨论了大白菜游离小砲子培养的影响因素：材料的基因型、供体植株的生理状况、小鞄子发育时期、分离和培养方法、预处理、培养基及其添加物、胚状体诱导、植株再生和倍性鉴定等。展望了大白菜游离小胞子培养技术的应用前景，同时指出了这一研究领域存在的问题。关键词：大白菜；游离小砲子培养；进展大白菜(Brassicarapassp・Pekinensis)是十字花科芸薑属(Brassica)中最重要的蔬菜作物之一，原产中国,是中国乃至世界性的大宗蔬菜。大白菜在中国种植广泛，其品种繁多，风味各异，且生长周期

2、短，适应性强，可以周年供应，在蔬菜市场中占据重要地位。由于大白菜是异花授粉植物，杂种优势十分明显，因此培育纯合稳定的双单倍体(DH系)植株在遗传育种研究中具有非常重要的意义。小胞子是高等植物生活史中雄配子体发育过程中短暂而重要的阶段，是减数分裂后四分体释放出的单核细胞。游离小胞子培养是指不经过任何形式的花药预培养，直接从花蕾或花药中获得游离的、新鲜的小胞子群体而进行培养的方法。1982年Lichter[l]首次报道了在芸薑属作物中应用游离小砲子培养技术，并取得了成功。大白菜游离小胞子培养研究始于1989年，日本学者Sato［2］首次利用大白菜游离小胞子进行培养，获得了再

3、生植株。以后的二十几年时间里许多学者相继对影响小范子成胚及植株再生的因素进行了探讨，并取得了很大进展。1胚的诱导胚的诱导在整个小胞子培养过程中占有举足轻重的地位，胚诱导成功与否受材料基因型、供体植株生理状况、小鞄子发育时期、培养基、培养方式、培养条件等多种因素影响。1.1基因型基因型对胚的诱导的影响主要表现在2个方面，一是能否诱导出胚，即供体材料培养的成功率，二是在能诱导出胚的前提下，比较不同基因型材料之间胚诱导率的高低。北京农业生物技术研究中心的曹鸣庆等［3］报道，胚培养成功率为94%,胚诱导率最高的基因型平均每个花蕾出胚359.28个;而河南省农科院园艺所的栗根义等

4、［4］研究表明，胚诱导培养成功率为93%,最高诱导率为每个花蕾平均产胚178个；山西省农科院蔬菜所王秀英等［5］的研究结果是培养成功率为50%,胚诱导率最高的基因型平均每个花蕾出胚86.41个;许艳辉等［6］的试验，培养成功率为18.9%,胚诱导率最高的基因型平均每皿产胚187个，出胚量最低的基因型平均每个花蕾出胚都在1个以下。张凤兰等［7］认为不同基因型大白菜胚状体发生能力有明显差异。小胞子胚胎发生能力同其他遗传性状一样，是一种受基因调控的遗传特性［8］。1.2供体材料的生理状况供体材料的生理状况对胚的诱导有直接影响。Sato等［2］对生长在人工气候室（温度20°C,

5、光照16h/d,光照强度10000lx）内的材料进行小砲子培养，获得了较理想的结果。张凤兰［7］报道，来源于14〜18h长日照，15〜20°C的供体植株的胚诱导率高。曹鸣庆［3］研究发现，生长在10〜25°C控温温室的材料，小胞子胚产量较高；生长在温度日变化10-35°C条件下的田间材料，小胞子胚产量明显下降。王秀英等［9］将供体材料种植在不可控温的连栋温室内，由于通风条件不太好，15:00左右温度可达40°C,但生长在里面的夏白菜出胚率较高，而春白菜和秋白菜出胚率则较低，可能是由于夏白菜耐高温的原因。1.3小胞子的发育时期栗根义等［4］研究发现，小胞子培养的最佳时期是

6、单核晚期至双核早期，此时的花蕾长度为2.0〜2.5mm,花瓣与花药长度比为1/2〜3/4。另外，花蕾大小还与基因型、生长条件及花蕾在植株上所处的位置有关［10］,因此在培养之前，必须进行镜检以确定小胞子发育时期。而王秀英等［11］研究发现，即使是小砲子发育处于单核晚期至双核早期，取蕾时间不同，胚诱导率也不同，下午取蕾的胚诱导率要比上午高。石淑稳等［12］研究报道，同一材料第一天取蕾培养效果好，第二天取蕾培养效果则不一定好，这可能与田间植株每天所遇到的自然气候不同有关，因此同一个材料往往需要重复接种培养。笔者在小胞子培养的实际工作中也遇到过同样的情况。1.4小砲子的分离和

7、培养方法小胞子培养为液体悬浮培养。挤压法是最常用的分离方法，是将无菌花蕾在研钵或大试管内挤破散出小胞子，经过滤、离心、纯化，转移到液体培养基中进行培养。培养方法是小胞子先经33°C热激24h后，转入25°C常温培养至胚形成。培养方式有液体静置培养和振荡培养2种。蒋武生等［13］研究发现，转入25£常温培养，采取连续振荡培养的方式，有利于小鞄子胚的诱导形成和子叶胚的比例提高。申书兴等［14］研究报道，小砲子先静置培养2周，再振荡培养1周（60r/min）,可促使原胚迅速发育成子叶胚，并提高胚发育的同步性。顾宏辉等［15］的研究结果表明，33