northern杂交试验指导手册

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1、Northern杂交试验指导手册Northern杂交试验指导手册DIG标记的Northern杂交试验指导一、RNA提取方法一、改良异硫氟酸弧提取法试剂及其配制异硫鼠酸弧变性液：贮存液一在含484ml水(经DEPC处理),17.6ml0.75mol/L柠檬酸钠(pH7.0)和26.4mllO%Sarkosyl的溶液中加入250g界硫氧酸呱，加热至60"65°C并持续搅拌使之充分溶解。贮存液室温保存备用(不超过3个月)。工作液一在每50ml贮存液屮加入0.35ml2-ME即配制成工作液。工作液于室温下保存不超过1个刀。工作液各成分的终浓度为：4mol/L异硫鼠酸呱25

2、mol/L柠檬酸钠pH7.00.5%(w/v)N-十二烷基肌氨酸(Sarkosyl)0.lmol/L疏基乙醇(2-ME)其它溶液：2mol/L乙酸钠(NaAc)缓冲液(pH4.0)水饱和酚(pH3.5)49:1(v/v)氯仿/异戊醇100%异丙醇70%乙醇(用DEPC处理水配制)DEPC处理后高压灭菌水试验程序1.取0.5〜lg左右新鲜植物组织置于研钵中，加入液氮，迅速研磨成均匀的粉末。2.将粉末全部移入冰上预冷的离心管中，并向其中加入5ml显硫氤酸呱变性液，轻轻摇动离心管使混合均匀。3.顺序加入2mol/lXaAc0.5nil＞水饱和苯酚5ml、氯仿/异戊醇lm

3、l,每加入-种试剂都轻轻摇动离心管混合均匀，最后将离心管盖紧，倒转几次混合均匀，冰浴15min.。4.4°C条件下15000g离心30min.,将上层水相转移至另一干净的离心管中，并加入等体积的异丙醇，混匀后置于一20°C冰箱冷冻lh.。5.4°C条件下13000g离心25min.,小心去除上清液，沉淀溶于1.5ml界硫酸呱变型液•I1(体积为第一次变性液的1/3)，再加入等体积的异丙醇，混匀后置于一20°C冰箱冷冻lh.01.4°C条件下13000g离心20min.,沉淀用70%乙醇洗一次，晾十后溶于适量体积(50ug/100ul)的DEPC处理水中，检测后分装

4、，置于一70°C低温条件下保存。注意事项RNA捉取过程中，为了保证所捉取的RNA的纯度和完整性，其中有两个方而的问题需要特别控制,一是去除与RNA结合的蛋白质，二避免内外源Rnase对RNA的降解。在RNA的提取屮，常采用的蛋白质变性剂冇苯酚、氯仿、十二烷基磺酸钠(SDS)等。为防止外源Rnase的污染，所有试验用詁均需用DEPC处理并高压火菌，所有试剂配制均需使用经DEPC处理过的水或灭菌处理。内源RNase的抑制采用杲硫鼠酸脈等强述原剂。为避免人体污染，所有试验操作均应带手套，避免人体接触所有用品。方法二、改良Krapp提取法试剂及其配制RNA抽提掖：母液：4

5、mol异硫氧酸弧20mmolEDTA20mmolMESpH7.0工作液：取400ml母液加入1.7ml2-ME贮存在4°C条件下备用。RNA重悬液:2molLiCllOmmolNaAc调整终体积为250ml,pH5.2,灭菌后贮存在4°C条件下备用。试验程序1.取新鲜植物材料0.5^1g,冷冻干燥。如果必要可加入0.2呂砂一起研磨，然后加入10mlRNA抽提掖充分混匀。2.4°C条件下8000rpm离心lOmin.,将上层水相转移至一干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿抽提掖，在4°C条件卜8000rpm离心lOmin.o3.清液转移至一干净离心管中，再用10ml氯

6、仿洗上清液1次(加入10迅氯仿充分混匀后，在4°C条件T8000rpm离心lOmin.)04.小心将上清液转移至另一干净离心管中,加入1/10vol3molNaAc和2vol冷无水乙醇，在-80°C条件下沉淀2小时。5.在4°C条件F8500rpm离心30min.,小心弃去上清液,沉淀重悬于RNA重悬液中,置于4C条件下1小吋。6.4°C条件下8500rpm离心lOmin.,弃去匕清液,沉淀溶于适当体积的DEOC处理水中。检测后分装，置于-70°C条件下保存。一.、RNA质最检测提取的RNA需要对其质虽和数量进行检测。实验室常用的方法有紫外吸收值检测和电泳检测两种

7、。方法一、紫外吸收检测试剂：TE(10mmol/LTris,lmmol/LEDTA)odH2O试验程序1.预热紫外分光光度计10〜20min.o2.取两个lml的狭缝石英杯，一个装入lmlTE溶液作为空白校止液，用来校止分光度计零点及调整透光度至100o3.取4ulRNA待测样品加入另一比色杯中，加dH20至51,用无菌石蜡膜堵住杯口，倒转混匀。4.将两个比色杯置于分光光度计小，调入射光波长，用空口溶液分别调整T至100、0D至0,然后测定样品在260nm>280nm、230nm的0D值。RNA浓度和纯度分析浓度计算:对于单链RNA,0D260=l.0时,RNA浓

8、度为40u