不同剂量脂多糖预处理对哮喘小鼠肺部炎症影响探究

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1、不同剂量脂多糖预处理对哮喘小鼠肺部炎症影响探究作者：李鸿佳，王淑娟，李艳丽，董亮【摘要】目的：研究不同剂量脂多糖(LPS)通过诱导肺泡巨噬细胞(AM)Toll样受体4(TLR4)的高表达，探讨其对哮喘小鼠肺部炎症的影响。方法：BALB/c小鼠随机分为哮喘模型组(OVA)A,低剂量LPS处理组(0.lmg/LLPS+OVA)B,高剂量LPS处理组(100mg/LLPS+OVA)C,对照组(生理盐水)Do用卵白蛋白(OVA)致敏与激发建立小鼠哮喘模型；酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)上清中IL4、IL5、IL13和IFNY的含量，

2、实时荧光定量PCR法测定AM的TLR4的表达，光镜观察肺组织病理变化。结果：与A组相比较，B组BALF±清中IL4、IL5和IL13的水平显著增髙(P<；O.05),而IFNY差异无统计学意义(P>；0.05),C组BALF±清中IL4、IL5和IL13的水平显著降低，IFNY显著增高(P<；O.05)；与A组相比，B组与C组AM的TLR4mRNA表达均明显增高(P<；0.05),两组间差异无统计学意义;光镜下，A组支气管黏膜下水肿，黏液腺增生，可见大量以嗜酸性粒细胞为主的炎症细胞浸润。B组与C组上述情况未见减轻，并出现肺泡腔及间质充血，中性粒细胞

3、等大量的炎症细胞浸润，D组管腔内无黏液栓，气道周围无炎症细胞浸润，肺泡壁结构完整。结论：低剂量LPS(0.1mg/L)诱导哮喘小鼠AM的TLR4高表达，使肺部炎症加重，而高剂量LPS(100mg/L)可能会减轻变态反应症状。【关键词】肺泡巨噬细胞；脂多糖；Toll样受体4；支气管哮喘支气管哮喘(简称哮喘)是一种以嗜酸性粒细胞为主的众多炎症细胞和炎症因子参与的慢性气道炎症性疾病[1],其发病率呈逐年上升趋势，室内灰尘，革兰阴性杆菌的内毒素等在哮喘气道炎症中的作用存在很大的争议。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌的一类重要的病原体微生物成分,研究发现，LPS浓度可影响T

4、hl/Th2炎症反应。高水平LPS可使具有抗原特异性的Thl反应增强，低剂量LPS可使Th2敏感性增高，提示LPS可能在过敏性炎症反应中具有独特的双向作用[2]oTLR4是LPS的主要模式识别受体，TLR4结合LPS等病原体相关分子模式后通过释放细胞因子可促进Thl细胞分化，从而可能在哮喘免疫和宿主保护中起重要作用，但目前尚没有足够证据证明TLR4能直接识别Th2型免疫应答。我们试图运用不同剂量LPS干预小鼠哮喘模型，研究LPS诱导AM表面TLR4激活机制，探讨TLR4激活在哮喘发病机制中的信号转导途径，进一步明确其在哮喘小鼠气道炎症加重的机制中的作用。1材料和方

5、法1.1材料鸡卵蛋白(OVA,GradeV,纯度＞98%,Sigma),超纯脂多糖(ultrapureLPS,E.coli0111：B4,Sigma),BALB/c小鼠(6〜8周龄，雌性)由山东大学试验动物中心提供，小鼠IFNY和IL4ELISA试剂盒购自深圳晶美生物公司，小鼠IL5和IL13ELISA试剂盒购自上海西唐生物公司，总RNA抽提与纯化试剂盒购自Roche公司，SYBRGreenI购自Roche公司，SpectorI型酶标分析仪(美国)。1.2方法1.2.1动物分组与模型建立将40只雌性BALB/c小鼠随机分为4组，每组10只，A组为哮喘组，B组为低剂

6、量LPS处理组(0.1mg/LLPS+OVA),C组为高剂量LPS处理组(100mg/LLPS+OVA),D组为生理盐水对照组。A组于第1(实验开始当天)、8d分别腹腔内注射OVA混悬液每次50Pg,[0VA/AL(0H)3为10mg/g],第15天将小鼠置于自制的有机玻璃盒中，给予雾化吸入OVA(10g/LOVA/PBS),每天30min,连续1周。D组致敏与激发均以生理盐水代替OVAoB组和C组分别在致敏阶段每隔2d腹腔注射ImL含0.1、100UgE.coliLPS,激发阶段在每次激发前1h腹腔注射相同剂量浓度E・coliLPSo各组小鼠在末次激发24h以后

7、处死。1.2.2BALF标本的收集对小鼠行气管插管，在左主支气管处结扎左肺，用3mL冰磷酸盐缓冲盐水(PBS)分3次灌洗右肺，回收液体量>；80%为合格，约2.5mL/鼠，1000r/min,离心10min,4°C离心，收取各组细胞上清液，-80°C保存待测。1・2.3AM的分离与培养BALF离心后沉淀用生理盐水3mL重悬、再离心，反复洗涤3次，然后用RPMI1640培养液(含2mmol/L谷胺酰氨,100mL/L胎牛血清，100U/L青霉素，100U/L链霉素)4mL混悬细胞，于孵箱中37°C>50mL/LC02孵育2h后，轻轻吸出上清，去除非贴壁细胞。用含

8、100mL