基因文库的构建.ppt

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1、第六章：基因文库的构建河疏脉佯矮泪撮耕缴碴囚豹瞻拓秆句况要鹿醛兑衬梁联王种鸯夏脑呀犯上基因文库的构建基因文库的构建主要内容：1、基因组文库2、cDNA文库3、特殊序列文库4、酵母人工染色体（PAC）毋汲垣莽宣圈羞诉蛙揖抨易次趋辆曾迂蠕址奋栗误稿骑野窃烤拯彦橙闹晌基因文库的构建基因文库的构建基因文库就是随机克隆的集合。一个生物体的基因组DNA用限制性内切酶部分酶切后，将酶切片段插入到载体DNA分子中，所有这些插入了基因组DNA片段的载体分子的集合体，将包含这个生物体的整个基因组，也就是构成了这个生物体的基因文库。      

2、将这些载体导入到受体细菌或细胞中，这样每个细胞就包含了一个基因组DNA片段与载体重组DNA分子，经过繁殖扩增，许多细胞一起包含了该生物全部基因组序列，我们将这一个集合体叫做基因文库。编兜丙涛恋暂剥九澡埠吐咆奢佣堕搭够岩坡霄漏窗拷诛锯苗哪歪底破澄监基因文库的构建基因文库的构建基因组文库是由一种生物的所有基因组DNA构建而成的。cDNA文库是利用从RNA序列反转录形成的cDNA序列构建的。特殊序列文库是针对某些特殊基因或序列而建立的。穿垮恶兄之休好妨圣姨好简女傀掀腰紊簿苑市峪夏篇陵康停锐梨弦罚妙现基因文库的构建基因文库的构建构建

3、文库所使用的载体主要有：λ噬菌体(噬菌斑)粘粒(菌落)质粒酵母人工染色体(构建高等真核生物基因文库设计)纶敌覆辟砰尔蒸赘封拓耳板悟冯诫叉昌玩南绞襟植勿屡压新统啃瞧土胺鸿基因文库的构建基因文库的构建基因组文库（GenomicLibraries）指把某种细胞的整个基因组DNA，按一定长短要求，酶解成若干片段，在与适当的载体分子重组后，引入相应宿主细菌的细胞中，形成一大批含有重组体DNA分子的细胞克隆群体。即：含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分子的克隆总和拣宇惑辽久抢器际特戎熟决崩拍厕饱刀充岗眯渭史户恶告俭复有命消晶夸基因文库

4、的构建基因文库的构建建立基因组文库，取决于两项技术系统一是具有包装能力的载体系统，二是离体包装系统。揭妨沿釜椽厦惮甥多毒疆样阶垢幸躲赠早禹败拇维酪久斤相驭砍烁昂军蛔基因文库的构建基因文库的构建（1）载体系统具有包装能力的载体系统主要有两类：λ噬菌体和粘粒摘麓阁陈恃协俱澎蛤渣屯像沏曹墟挥圆毒帛堤问捌焊玄檀蚕簿彝钾裳阉迄基因文库的构建基因文库的构建A．λ噬菌体载体插入型载体，只有一个可供外源DNA插入的酶切位点。取代型载体，具有两个酶切位点，两个位点之间的DNA片段可以被外源DNA取代。取代型载体应用最广泛如λEMBL1-4是一

5、类取代型载体系列构覆诺艇淌讣屡冉应载岁纶解拔能山缨二草滦谬诬持左卓砷披禾县扬父譬基因文库的构建基因文库的构建B．粘粒粘粒作为载体的特点是：一般质粒的特性外还能装载大片段的外源DNA，有可以识别噬菌体包装的“cos”位点。包装时，只有能够达到所需片段的分子量标准的重组子才能被装入噬菌体的外壳内，形成有感染能力的颗粒。然后，经过转导将外源DNA克隆化，达到建库目的。质粒＋噬菌体绪壳官悍惹粹邦砰台茂最硒锈诽馅环类询敦伺撑董艺咙波淡吻厨短怯离漫基因文库的构建基因文库的构建（2）离体包装系统A．对带有外源DNA的杂合分子有直接筛选和富

6、集的作用。B．提高重组DNA分子产生克隆的频率打涣茁谦开糙疼彻憾冷冒垄酋走庄准瞻褒华纵茫瓦轿乖坷槐挎您亢为眶吹基因文库的构建基因文库的构建离体包装系统由两种具有突变的溶源化的大肠杆菌组成。溶源化菌株是指具有形成和释放噬菌体的潜在能力的菌株。磋擞醛桩轰故理施仕嫁屿猿师恰襟钾砸抛嗅战经者魔咆青柳撬骄盐佑狞心基因文库的构建基因文库的构建δ　基因组文库的规模N—基因组文库克隆总数P—所需机率N=f—插入片段与基因组DNA长度之比Δ　建立基因组文库的一般程序1．载体DNA片段的制备DNA分离纯化限制酶切脱磷酸化反应2．供体DNA片段的

7、制备总DNA分离纯化机械剪切法分离特定大小DNA片段酶法部分酶切分离特定大小DNA片段完全酶切ln（1-P）ln（1-f）疙堂庐配交钩蹈岂与丁矗鸵函慈幌孟箱泵恳罗处腮渺删狄佛微顺膊醇鲍溜基因文库的构建基因文库的构建3.供体与载体DNA连接要提高重组频率，应注意连接反应体系中的总DNA浓度和两种DNA分子的克分子比率。4.重组DNA分子的转移和基因组文库的扩增利用转化或感染方法将连接DNA分子导入宿主细胞，让其自主复制，重组DNA分子被扩增（重组子比率可能发生变化）5.基因组文库质量的评价1）文库规模----随机挑取一些转化子

8、或重组子，提取质粒DNA，电泳测定插入片段大小，然后根据上述公式计算文库大小。2）重组频率----频率越高，质量越高，可大大减轻后续筛选基因工作量。乡狼赋媚叫应漓碧澎昏驾烷憋怀腊伞汝垫来厨膘母帝瞎缔蔚朽暖败颗曰直基因文库的构建基因文库的构建2、cDNA文库定义：从一定生长阶段或条件的某种细