实验六侧孢芽胞杆菌菌种活化及复壮.doc

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1、实验六侧孢芽胞杆菌菌种活化及复壮一、实验目的1.了解菌种衰退的原理．2.熟悉发酵菌种活化和复壮的方法．二、实验原理菌种在传代过程中，原有的生产性状会逐渐下降，这就是菌种的衰退。衰退是菌株的自发突变引起的，一旦发现衰退，就必须进行复壮。复壮就是通过纯种分离和性能测定等方法从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌种原有性状的一种措施。菌种活化就是逐级扩大培养是为了得到纯而壮的培养物，即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。菌种发酵有一般需要2-3代的复壮过程，因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所以要活化,让菌种逐渐适

2、应培养环境。三、实验器材与试剂1、菌种侧孢芽胞杆菌斜面保藏菌种2、实验器材天平、手提式电热灭菌锅、超净工作台、接种环、电热鼓风干燥箱、生化培养箱、光学显微镜、电炉、酒精灯、铁架台、玻璃漏斗、试管、三角瓶、载玻片等3、试剂葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、复红染色液、结晶紫染色液、卢哥氏碘液、95%乙醇、番红染色液、香柏油、氢氧化钠、盐酸四、实验步骤1、斜面培养基配方：葡萄糖10g、蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、水1000mL、琼脂20g、pH值7.2～7.4。2、按配方准确称取所需的药品，溶解、过滤、分装、包扎、灭菌（1

3、21℃30min）、冷却、摆斜面。3、斜面无菌检查。28℃，37℃恒温培养箱培养观察。4、接种：无菌室清洁、紫外灯灭菌、操作人员清洁、消毒、用接种环接种斜面。5、培养：37℃恒温培养箱中培养1d。6、重复转接3代斜面7、镜检。分别用简单染色或革兰氏染色涂片观察，菌的生长情况，是否有杂菌。8、生长好的菌种置冰箱中保藏备用。五、注意事项1、灭菌要彻底，冷气一定排尽，并保证灭菌温度和时间。2、接种时要严格按无菌操作规程进行。六、作业记录实验结果（培养基灭菌效果、斜面生长情况、镜检结果）七、思考题无菌操作要注意哪些问题？实验七沙土管干

4、燥法保藏菌种1实验目的了解菌种保藏的基本原理。掌握几种常用的菌种保藏方法。2实验原理菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏的方法很多。其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境，即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。斜面保藏、半固体穿刺、石蜡油封存和沙土管保藏法较为常用，也比较容易操作。3实验材料3.1菌株待保藏的适龄菌株斜面。3.2培养基肉汤蛋白胨斜面、半固体及液体培养基。3.3试剂10%HCl、

5、无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。3.4器具及其他用品用于菌种保藏的小试管（10mm×100mm）数支、5mL无菌吸管、1mL无菌吸管、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱、无菌水、筛子（40目、120目，孔径/mm=）、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。4沙土管保藏步骤4.1流程制沙土管→灭菌→制菌液→加样→干燥→保藏4.2步骤（1）制作沙土管 选取过40目筛的黄沙，酸洗，再水洗至中性，烘干备用，过120目筛子的黄土备用；按1份土加4份沙的比例均匀混合后，装入小试管，装量1cm左右。（2）灭菌 加压蒸汽灭菌，直至检测无菌为止。（

6、3）制备菌液 取3mL无菌水至待保藏的菌种斜面中，用接种环轻轻刮下菌苔。振荡制成菌悬液。（4）加样 用1mL吸管吸取上述悬液0.1mL至沙土管，再用接种环拌匀。（5）干燥 把装好菌液的沙土管放入干燥器或同时用真空泵连续抽气，使之干燥。（6）保藏 干燥后的沙土管可直接放入冰箱中保藏；也可以用石蜡封住棉花塞后放冰箱中保藏。5思考题（1）菌种保藏应注意哪些问题？（2）沙土管法适合保藏哪一类微生物？实验八侧孢芽胞杆菌液体发酵培养基优化一、实验目的1、掌握发酵培养基配制的原则2、熟悉优化发酵培养基的方法：正交试验、均匀化设计、响应面法、

7、二次正交旋转法。主要选用正交试验，也可用其他方法。二、实验原理发酵培养基是指大生产时所用的培养基，由于发酵产物中一般含有较高比例的碳元素，因此培养基中的碳的含量也应该比种子培养基中高，如果产物的含氮量高，还应增加培养基中的氮源比例。但必须注意培养基中的渗透压，如果渗透压太高，又会反过来抑制微生物的生长，在这种情况下可采用流加的方法逐步加入碳氮源。培养基组分对发酵起着关鍵性的影响作用。工业发酵培养基与菌种筛选时所用的培养基不同，一般以经济节约为主要原则，因此常用廉价的农副产品为原料。选择碳源时常用山芋粉、麸皮、玉米粉等代替淀粉，

8、而用黄豆粉、豆饼粉等作为氮源；此外，还应考虑所选原料不至于影响下游的分离提取工作。由于这些天然原料的组分复杂，不同批次的原料成分各不相同，在进行发酵前必须进行培养基的优化试验。三、实验器材与试剂1、菌种：侧孢芽胞杆菌斜面菌种2、种子培养基：蔗糖1.5%、蛋白胨0.2%、酵母膏