攀西金龙胆草种质资源及其查尔酮合酶基因和β-香树酯合酶基因的克隆研究.pdf

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1、万方数据ThestudyofgermplasmandmolecularcloningofChalconeSynthasegeneandp-amyinsynthasegenefromConyzabliniiH．L6v．inPanxiareaADissertationPresentedtoLifeandBasicSciencesCollegeofSichuanAgriculturalUniversityinPartialFulfillmentRequirementfortheDoctorDegreeofPhilosophyShanLiuDirectedbyProf．HuiChenY

2、a’an625014，SichuanP．R。ChinaJune2014万方数据论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生躲言＼竹扣11年s只，2B关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和

3、电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。舀本论文不保密。口本论文保密，在一年解密后适用本授权。研究生签名：吝、d蚕鲁／研究生签名：虿＼舯铷签名：铂耖曲，眵年加fV年6月fZ日6月f≯日万方数据摘要金龙胆草(ConyzabliniiH．L6v．)是一种菊科白酒草属植物，主要呈野生状态，分布于四川攀西地区、云南中南部及贵州部分地区。其活性成分在慢性支气管炎、胃溃疡等疾病的治疗上具有良好疗效。多年来，金龙胆草的研究集中在化学成分种类和主要活性成分药理药效等方面，对

4、其有效成分含量的研究却鲜见报道，基于分子生物学层面的研究更属于空白领域。本研究广泛收集了金龙胆草资源在主产区攀西地区的分布信息，对采集的样品利用ICP．AES手段进行了无机元素含量检测，利用紫外分光光度法进行了总黄酮和总皂苷含量的检测，利用高效液相色谱法进行了芦丁、槲皮素和苦蒿素含量的检测；通过RAPD、SRAP和SCAR分子标记对该区域内野生金龙胆草居群间的遗传多样性进行了研究；利用RACE技术克隆了金龙胆草黄酮代谢途径的关键酶查尔酮合酶基因和三萜皂苷代谢途径的关键酶D．香树酯合酶基因。主要结果如下：1．以攀西地区野生金龙胆草生长环境为背景，研究了金龙胆草的生长环境和植物形态

5、，发现金龙胆草在不同的生长时期植物形态变化较大。比较了野生和人工栽培植株叶片的超显微结构，扫描电镜结果显示，除人工栽培品种的叶片上偶可观察到圆形气孔外，两类叶片的腺毛、非腺毛、表皮等的显微差别并不大。2．无机元素的含量检测结果显示，5个不同来源的金龙胆草均不含重金属Cr和Cd，而Fe／Mn含量均较高，除烈元素显示出凉山州样品明显较多外，其它元素在样品间的含量较为相似。对16个不同来源的金龙胆草进行了总黄酮和总皂苷含量的检测，总黄酮含量较高，在4．660％,--7．530％之间：对花期植株花、叶、茎、根四个组织部位的黄酮成分芦丁、槲皮素进行了测定，发现芦丁和槲皮素含量均为叶中最高

6、，含量分别占总黄酮成分的0．478％和O．158％。三萜总皂苷的含量在0．566％--,0．909％之间，且以叶中最高；二萜成分苦蒿素的含量在0．560％1．185％之间，以叶中含量最高。抗氧化实验显示金龙胆草粗提物及分离纯化的总皂苷对DPPH自由基和羟自由基均有较好的抑制作用。以总黄酮、总皂苷和苦蒿素含量为指标，将攀西16个来源的金龙胆草聚为四大类，聚类的结果显示有效成分含量的相似性并不完全与其所处地理位置的远近相关，说明野生金龙胆草次生代谢物的产生不仅与地理位置有关，还可能与纵向海拔等生长地的小物候环境有关。3．利用RAPD和SRAP分子标记技术对l6个不同来源地金龙胆草进

7、行了遗传多1万方数据样性研究，15条RAPD引物和12对SRAP引物分别获得140个和318个多态位点，平均相似系数分别为0．6732和0．6804。合并的RAPD．SRAP标记结合了两种标记的特点，得到平均遗传相似性为0．6787，数据显示金龙胆草在攀西地区遗传多样性并不丰富，这可能与该植物生长地较集中，区域内能进行基因交流的国土面积不大有关。RAPD．SRAP标记将16个不同来源样品聚为三类，聚类结果与地理位置十分相关，来自攀枝花市的样品和凉山州的8、9样被聚为I类，凉山的10和11样被