DAF-16对秀丽线虫记忆行为的分子调控机制及其相关靶点的鉴定分析.pdf

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1、THEMOLECULARCONTROLOFMEMORYBEHAVIORBYDAF．16ANDIDENTIFICATIONOFITSRELATED弋人R哑忑s臌CAENoRHABDITISELEGANS。AThesisSubmittedtoSoutheastUniversityFortheAcademicDegreeofMasterofDevelopmentalBiologyBY1’1’HeKeweneSupervisedbyProfessorDayongWANGSoutheastUniversityMay，

2、2010+恻㈣必大学学位论文独创性声明学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并研究生签名：期：卫生盯以f东南大学学位论文使用授权声明东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文

3、外，允许论文被查阅和借阅，可以公布(包括刊登)论文的全部或部分内容。论文的公布(包括刊登)授权东南大学研究生院办理。研究生签名：趣雪蛊．导师签名：日期：坐-?中文摘要DAF．16对秀丽线虫记忆行为的分子调控机制及其相关靶点的鉴定分析东南大学摘要背景：胰岛素信号通路是一种神经内分泌型信号通路，在动物的衰老、发育、代谢、应激反应以及其他大量的生物学过程发挥着重要作用。胰岛素信号通路在物种间具有进化上的保守性，在秀丽线虫中该通路的功能主要由DAF．16蛋白所决定。目前的研究发现，线虫中胰岛素信号通路参与动物的学习

4、行为调节，并能保护动物衰老过程相关的学习能力下降。但是，尚不清楚胰岛素信号通路是否参与调控记忆行为。目前，采用染色质免疫沉淀技术(CHⅢ)已经鉴定出部分daf-16基因的靶位点，但这些靶点的功能尚不清楚。目的：本研究采用秀丽线虫作为模式生物，研究DAF．16对秀丽线虫记忆行为调控的分子机制并尝试鉴定出部分影响记忆行为的Ⅸ址．16靶点。方法：利用温度和化学趋向性模型证明胰岛素信号通路参与调节秀丽线虫的记忆行为。利用组织和细胞特异性启动子构建驱动daf-16基因表达的载体，应用基因枪技术转基因，在温度趋向性模型

5、下，进行DAF．16调节记忆行为的组织和细胞活性定位分析，鉴定DAF．16发挥记忆调控功能的特异性组织和神经元。利用RNAi技术构建DAF．16靶点基因的knockdown突变体，在温度趋向性模型下鉴定影响秀丽线虫记忆行为的靶点。结果：在温度趋向性模型下，DAF．16参与秀丽线虫记忆行为的调控，当daf-16基因突变后线虫的温度趋向性记忆行为可塑性出现明显缺陷，记忆能力衰退加快，记忆半衰期提前。进而在化学趋向性模型中对DAF．16的记忆调控功能进行了验证并得出了相同的结果。研究发现胰岛素信号通路同样参与到线

6、虫温度趋向性记忆行为的调控过程，在该功能中daf-16位于胰岛素信号通路的最下游，正向调控秀丽线虫的温度趋向性记忆功能，daf-2、age．J、akt-j、pdk-I位于胰岛素信号通路上游，对记忆功能进行负调控，并且daf-16可能作为胰岛素信号通路调控线虫温度趋向性记忆功能的唯一下游靶基因发挥作用。通过转基因技术使daf-16在daf-16(mu86)背景下表达可以使突变体的记忆缺陷得到恢复，另外，daf-16基因的过表达可以提高线虫的温度趋向性学习能力，这进一步验证了DAF．16在秀丽线虫温度趋向性记忆

7、行为调控功能中的作用。通过转基因技术，发现DAF．16对秀丽线虫记忆行为的调控功能具有神经组织特异性，进一步的研究发现daf-16只有在AIY、AIZ、ILIA神经元表达时才具有温度趋向性记忆的调控功能。在对秀丽线虫温度趋向性相关神经元的发育进行研究后发现，daf-16基因突变后线虫的AFD、AIY神经元的发育正常，未出现明显变化，说明daf-16突变后导致的线虫记忆功能的缺陷不是神经元发育或功能缺陷导致的，是机体内在分子调控机制的体现。在接下来的对daf-16与，彳．3—3、，z嚣．J『、dgk-3在记忆

8、调控功能中的遗传关系的研究中发现，daf-16与这几个基因在记忆调控功能上没有直接的上下游关系。利用温度趋向性模型，在所选取的34个DAF．16靶点基因中筛选出9个参与记忆功能调节的靶点，分别是用凹11．1(sod-2)、乃7刃．3(gst-2．爿、Y105E8B．9、C36A4．9(acs-19)、C29A12．3(1ig-1)、F28C1．2(egl-lO)、FlZE5．1(1in一2)、F42GlO．1翻C