自噬在小鼠卵母细胞老化与XRCC1在早期胚胎DNA去甲基化中的作用.pdf

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1、自噬在小鼠卵母细胞老化与XRCC1在早期胚胎DNA去甲基化中的作用Rolesofautophagyduringpostovulatoryagingof⋯一一一————mouseoocyteandrolesofXRCC1duringDNAdemethylationinmousepreimplantationembryo研究生：程来洋学科：临床兽医学导师：刘宗平教授扬州大学2014年6月程来洋：自噬在小鼠卵母细胞老化与XRCCI在早期胚胎DNA去甲基化中的作用中文摘要哺乳动物排卵后的成熟卵母细胞，由

2、于受精延迟而造成质量下降的现象被称为排卵后老化，发生老化但还没有退化的卵母细胞被称为老化卵母细胞，其仍具有受精能力，但会导致其后胚胎发育的异常和产生异常后代。已经发现在卵母细胞老化过程中存在一系列的细胞和分子变化，但对导致卵母细胞老化的分子机制仍不是很清楚。本研究利用免疫荧光和免疫印迹分析了小鼠卵母细胞在体内和体外老化过程中自噬的变化，利用自噬的特异性抑制剂或激活剂分别处理体外培养的卵母细胞后，观察卵母细胞的老化进程。结果显示，在卵母细胞的体内老化中，一定时间内随着老化时间的延长，卵母细胞的自噬

3、水平发生了显著的升高；利用自噬的抑制剂或激活剂人为的减弱或增强体外培养卵母细胞的白噬水平，会相应的减缓或加速排卵后卵母细胞的老化进程。结果表明，自噬可能是排卵后卵母细胞老化所必须的。DNA甲基化作为哺乳动物和植物体内一种重要的表观遗传修饰的形式，在调控基因表达和维持基因组稳定性等方面发挥着重要的生物学作用。在植物和动物细胞中均发现有DNA主动去甲基化现象，其机制在植物中己基本得到阐释，碱基切除修复通路己被证明在植物和斑马鱼中参与了DNA主动去甲基化的过程，但在哺乳动物中仍未找到一种有效的DNA去

4、甲基化酶，并且DNA主动去甲基化的途径还存在着不少争议。本研究中，我们首先通过免疫荧光技术检测XRCCl在卵母细胞至早期胚胎发育过程中的表达，然后利用显微注射技术将XRCCl的特异性抗体注射到细胞中封闭XRCCl蛋白的功能，最后通过体外培养并利用免疫荧光分析卵母细胞和早期胚胎的发育及其5-mC的表达。结果显示，XRCCl蛋白在减数分裂和有丝分裂间期表达，分裂期不表达，与细胞核染色质DNA共定位；GV期卵母细胞在显微注射XRCCl抗体后，其GVBD的发育率极显著下降；MII期卵母细胞在显微注射XR

5、CCl抗体后，经体外培养检测其5-mC的表达水平未发生显著变化；显微注射XRCCl抗体的受精卵经体外培养发育至2-cell的胚胎，其5-mC的表达水平发生极显著升高，进而导致其发育率显著降低。结果表明，XRCCl可能在早期胚胎的DNA去甲基化和生长发育中发挥了作用。关键词：自噬；卵母细胞；老化；XRCCl；5-mC；早期胚胎；DNA去甲基化扬州大学硕士学位论文RolesofautophagyduringpostovulatoryagingofmouseoocyteandrolesofXRCC1d

6、uringDNAdemethylationinmousepreimplantationembryoABSTRACTInmostmammals，matureoocytesafterovulatioundergoaprocessofdeteriorationinquality,whichiscalledoocyteaging，iffertilizationisdelayed．Theagingoocyteisnotdegenerateandisstillfertilizability,whichcau

7、seabnormityofembryodevelopmentandoffspring．Oocyteaginginvolvesarangeofcellularandmolecularchanges，butthemechanismofoocyteagingisnotwellunderstood．Inthisexperiment，weusedimmunofluorescenceandimmunoblottingtoexaminetheautophagylevelsduringinvivoandinvi

8、trooocyteaging．Theprocessofoocyteagingthatweretreatedwithinhibitorandactivatorofautophagywasalsoinvestigated．Theresultsshowedthattheautophagylevelsinmouseoocytesweremarkedlyincreasedduringinvivoandinvitropostovulatory,andthelevelsofinvitroagingweregr