荧光偏振免疫分析方法快速检测沙拉沙星残留.pdf

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1、第40卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第8期2012年8月ChineseJournalofAnalyticalChemistryl2471251DOI：10．3724／SP．J．1096．2012．20010荧光偏振免疫分析方法快速检测沙拉沙星残留宋佩孟萌SergeiAEremin张太昌田溪薛虎寅张昱尹永梅郗日沫(南开大学药学院，南开大学药物化学生物学国家重点实验室，天津市分子药物研究重点实验室，天津300071)(FacultyofChemistry,M．V．LomonosovMoscowStateUniversity,Moscow1

2、19991，Russia)摘要以异硫氰酸荧光素(FITC)标记沙拉沙星合成荧光标记物，采用薄层色谱法提纯，优化了反应时间、标记物和抗体的工作浓度，建立了沙拉沙星的快速荧光偏振免疫分析法(FPIA)。本方法测定沙拉沙星在缓冲液中的半数抑制浓度(IC。)为43-2g／L；检测范围为5．7～327g／L，可以达到国家规定的动物性食品中兽药最高残留限量(80~tg／kg)的要求。本研究考察了FPIA测定沙拉沙星的动力学过程及对其它4种喹诺酮类药物的交叉反应。结果表明，环丙沙星、恩诺沙星、加替沙星及氧氟沙星的交叉反应率分别为3．3％，1．8％，1．7％和O．

3、7％。在牛奶和猪尿中沙拉沙星的回收率分别在71％～94％和74％～102％之间。本方法操作简单快捷，整个检测过程只需5min、而且灵敏度较高、特异性强，适用于动物性食品中沙拉沙星残留的快速筛选检测。关键词荧光偏振免疫分析；沙拉沙星；喹诺酮类药物；荧光标记1引言沙拉沙星(Sarafloxacin，SAR，图1)属于动物专用的氟喹诺酮类药物，其盐酸盐主要用于治疗鸡与猪的细菌及支原体感染所致的疾病1。盐酸沙拉沙星OH的半衰期较长，过量的药物残留会直接危害动物乃HOH至人体健康。我国规定动物性食品中兽药沙拉沙星的最高残留限量不得超过80~tg／kg。F目前

4、，(氟)喹诺酮类药物的检测方法主要有微FHoSARSAR．FITC生物法嘲、仪器分析法、化学发光分析法及免疫分析法。微生物法主要用于大量样品的快速筛选；常用图1沙拉沙星和沙拉沙星荧光标记物的分子结构Fig．1MolecularstructureofSarafloxacin(SAR)and的仪器分析法有高效液相色谱法[4]、液相色谱一质谱联用分析法和毛细管电泳法嘲等，此类方法的缺点saran0xac叶¨是所用仪器昂贵且样品前处理较繁琐，不适合大量样品的快速检测；免疫分析法灵敏度高、特异性强、快速准确，现已广泛应用于小分子农药以及兽药的筛选检测，但是大

5、部分属于固相免疫分析，操作中需要分离结合的和未结合的抗原(抗体)或酶标记物，耗时较长，所以迫切需要发展更加简便快速的分析方法。荧光偏振免疫分析法(FPIA)是一种快速简便高效的均相免疫分析方法，无需昂贵复杂的仪器，测定时间短。应用FPIA检测沙拉沙星的技术尚未开展。基于此，本研究合成并提纯了沙拉沙星荧光标记物，建立利用荧光标记物和沙拉沙星多克隆抗体检测沙拉沙星的荧光偏振免疫分析方法。2实验原理2O世纪2O年代，Perrin发现垂直方向的偏振光激发荧光分子之后，偏振光在垂直(II)和水平(∥)方向都会有荧光强度，因此可以得到荧光偏振强度值(P)：P一

6、(∥一I1)／(∥+II)fgJ。当溶液的温度和粘度固定不变时，P值主要取决于荧光分子的体积大小。小分子物质在溶液中旋转速度快，P值较小；大分子物质在溶液中旋转速度较慢，P值较大。2012一O卜O5收稿；2012-03—22接受本文系国家自然科学基金项目(Nos．81173017，31101277)，中央高校基本科研业务费项目(No．65011751)资助E-mail：xirimo2000@yahoo．com；yinyongmei@nankai．edu．cn分析化学第40卷FPIA是基于荧光标记抗原结合抗体后荧光偏振强度增强的检测方法。利用药物的标

7、准浓度与荧光偏振强度的线性关系作定量分析【ln“。另外，FPIA也可以进行抗体的检测】。FPIA是一种均相标记免疫分析技术，它避免了大量的分离和洗涤步骤，加样数分钟后即可检测，适于大量样品分析。3实验部分3．1仪器与试剂荧光偏振分析仪(DIACHEMIXSENTRY100)；液相色谱一质谱联用仪(AgilentG6520QTOF)。盐酸沙拉沙星(Dr．EhrensorferGmbH)；加替沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、盐酸环丙沙星对照品(中国兽医药品监察所)；5(6)一异硫氰酸荧光素(FITC，Sigma-Aldrich公司)；其它试剂均为分析纯(天津

8、光复精细化工研究所)；硅胶薄层色谱板(5cmX10cm，天津思立达科技有限公司)；SAR多克隆抗体(实验室自制)；牛奶(市