产壳聚糖酶的肠杆菌分离鉴定及其培养特性研究

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1、鲁东大学学报(自然科学版)LudongUniversityJournal(NaturalScienceEdition)2014，30(1)：43—47产壳聚糖酶的肠杆菌分离鉴定及其培养特性研究程仕伟，张盈，倪培拙，崔海洋，杨立红，马玉岳(1．鲁东大学生命科学学院，山东烟台264039；2．烟台恒源生物股份有限公司，山东龙口265709)摘要：针对筛选的一株产壳聚糖酶菌株进行了鉴定和培养特性研究．首先对产酶菌株进行鉴别培养基培养、显微镜检并结合生理生化与16SrDNA分子鉴定以确定菌属来源，后对菌株产壳聚糖酶的碳源、氮源、金属盐和诱导物进行筛选优化．结果表明：

2、产酶菌株为产气肠杆菌，最佳培养碳源为葡萄糖，最佳氮源为氯化铵和酵母粉，MnSO，MgSO，KC1和NaC1对产酶有积极作用．该菌来源的壳聚糖酶为诱导酶，最佳诱导物为粉末壳聚糖，壳聚糖酶活性为1．58U／mL．关键词：分离鉴定；肠杆菌；壳聚糖酶；培养特性中图分类号：Q93文献标志码：A文章编号：1673．8020(2014)01—0043—05壳聚糖是由2一氨基-D-葡萄糖和2一乙酰氨基-D-葡萄糖通过13—1，4糖苷键连接而成的天1材料与方法然高分子多糖J，但是其水溶性较差，能溶于弱酸且粘度大，因此限制了其广泛应用J．壳聚糖1．1材料与试剂经降解后得到的壳寡

3、糖与壳聚糖相比具有良好的水溶性，易被机体吸收，且具有许多独特的生理活3，5一二硝基水杨酸购自BBI公司，85％脱乙性_3J：可作为功能性食品添加剂和防腐剂；在酰度的壳聚糖购自济南海得贝生物工程有限公农业上是良好植物调节和生物防治剂，可开发为司，其余试剂均为分析纯或生物纯．无公害的新型生物农药；在医药上可开发成抗1．2仪器与设备癌、免疫系统药物j．壳寡糖的制备可采用化学降解法、物理降解法和酶降解法J，与常用的化TU．1810紫外可见分光光度计，北京普析通仪器；SW-CJ-1B超净工作台，苏州安泰；H1850R学降解法相比，酶降解法生产壳寡糖的反应条件温和且易控

4、制，产品得率高、功能性强，不会造成离1、5"机，湖南湘仪实验室仪器；HZQ—Q全温摇床，环境污染，是壳寡糖制备的主要方法J．哈尔滨东联；PCR扩增仪，BBI公司；凝胶成像系壳聚糖酶(Chitosanase，EC3．2．1．132)是一统，GeneGenius公司．类可催化壳聚糖的13—1，4一糖苷键断裂，专一性1．3菌株筛选降解底物制备壳寡糖的糖苷水解酶J，广泛存在于细菌m]、放线菌[“]、真菌等微生物中．不同市售鲜虾浸入无菌水中振荡10min后，稀释涂布以胶体壳聚糖为唯一碳氮源培养基上筛选，微生物来源壳聚糖酶催化特性存在差异，且因酶产生透明圈的为产壳聚糖酶

5、的微生物．筛选培养解作用模式不同造成产物壳寡糖聚合度不同．基(g／L)配方：酵母粉2，NH4C13，KHPO2，NaC1因此对产壳聚糖酶的微生物菌株进行广泛筛选，8，MgSO1，胶体壳聚糖6，琼脂2O，调pH5．8．选育出能够适用不同聚合度产品合成的生物催化剂具有积极意义．本文从鲜虾表面筛选的产壳聚1．4菌株鉴定糖酶菌株进行了分离鉴定及培养条件研究，旨在观察菌落形态，并经简单染色、革兰氏染色和为壳聚糖酶的微生物来源提供新途径．芽胞染色后显微镜检．菌株生理生化鉴定方法参收稿日期：2013—05-20；修回日期：2013—06-06基金项目：山东省高等学校科技计

6、划项目(J12LD02)；鲁东大学学生创新基金(12y039)作者简介：程仕伟(1976一)，男，山东潍坊人。讲师，博士，主要从事酶技术研究。E—mail：swbiotech@yeah．net。第1期程仕伟，等：产壳聚糖酶的肠杆菌分离鉴定及其培养特性研究45———————————0．001图3基于16SrDNA的系统发育树表1生理生化指标的测定结果O．7o．6炔谨O．0123456789图4碳源对菌株产壳聚糖酶的影响2．4氮源对菌株产酶的影响发酵培养基(L)：葡萄糖20，壳聚糖粉末1，不同氮源10(见图5)，MgSO1，MnSO0．5，NaC13，KC13，

7、pH7．0．发酵培养条件：温度30℃，转速200r／min，接种量4％(v／v)，发酵培养36h．由图5可以看出，氮源对菌株产壳聚糖酶的影响注：“一”为阴性，“+”阳性顺序分别为：NHC1>酵母粉>(NH)2SO>美蓝染色后镜检观察肠杆菌呈椭圆形，个体(NH4)2HPO4>NH4NO3>蛋白胨>牛肉膏>尿素>较小，革兰氏阴性，未见芽孢形成．该菌株的生理大豆蛋白胨，其中NHC1为最佳氮源，在此条件生化指标测定结果见表1，对照《伯杰氏细菌鉴定下壳聚糖酶活性为1．17U／mL．总体来说，无机氮手册》和《常用细菌鉴定手册》，其与产气肠杆菌源对菌株产壳聚糖酶有利，从增

8、加壳聚糖酶产量的培养特征高度相似．综合16SrDNA