氧化应激对copd大鼠膈肌影响及n-乙酰半胱氨酸的作用

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1、·2246·广东医学2010年9月第31卷第l7期GuangdongMedicalJournMSep．2010，Vd．31，No．17氧化应激对COPD大鼠膈肌影响及N一乙酰半胱氨酸的作用于敏，李永春辽宁医学院附属第一医院呼吸内科(辽宁锦州121001)【摘要】目的研究氧化应激对COPD大鼠膈肌萎缩的影响及机制和N一乙酰半胱氨酸对膈肌的保护机制。方法将24只SD雄性大鼠随机分为对照组、COPD组、N一乙酰半胱氨酸干预组(NAC组)。膈肌称重，透射电镜观察超微结构。检测各组大鼠膈肌中MDA含量、SOD活力、泛素蛋白表达及膈肌细胞凋亡指数(AI)。结果COPD组大鼠膈肌重量、SOD活力、

2、泛素平均灰度值均较对照组显著降低(P<0．01)；MDA含量、AI显著升高(P<0．01)；较COPD组NAC组大鼠膈肌重量、SOD活力、泛素平均灰度值均显著升高(P<0．O1)；MDA含量、AI显著降低(P<0．01)；COPD组较对照组膈肌超微结构损害明显，NAC组较COPD组明显改善。结论氧化应激水平升高使COPD大鼠膈肌萎缩，超微结构破坏，过多的氧自由基可通过使泛素蛋白及细胞凋亡增加致膈肌萎缩变薄。N一乙酰半胱氨酸可降低膈肌氧化应激水平从而起保护作用。【关键词lCOPD；氧化应激；膈肌；泛素；凋亡；N一乙酰半胱氨酸膈肌疲劳是COPD患者晚期呼吸衰竭的重要原箱内烟熏，烟熏箱有一

3、小孔与外界相通，保证常压状因，疲劳膈肌常常伴有膈肌细胞萎缩，肌细胞数量减态，保持烟雾浓度约在5％，0．5h，2次／d，2次间隔时少，从而导致其收缩能力降低。活性氧自由基引起的间大于4h，每天烟熏前对组内大鼠用生理盐水灌胃(1氧化应激可能是废用性肌萎缩的最主要诱因。本实验mL／只)；(3)NAC干预组：造模方法同COPD组，第2采用宋一平等¨方法复制大鼠COPD模型，予以抗氧～13、l5～28天每天上午烟熏前用NAC给大鼠灌胃，化剂N一乙酰半胱氨酸(N—acetylcysteine，NAC)进行每只50mg【2(用双蒸馏水稀释成1mL溶液)。干预，从氧化应激角度出发，探讨氧自由基对膈肌

4、组织1．2．2大鼠膈肌组织取材以5％乌拉坦(5mL／kg)的损害，从降解蛋白的信号途径一一泛素一蛋白酶体腹腔注射麻醉大鼠后，开胸立即取完整膈肌，生理盐水途径(UPP)以及膈肌细胞凋亡两方面探索氧自由基对冲洗，滤纸拭干，标准万分之一电子称测膈肌重量，将于膈肌萎缩的作用及N一乙酰半胱氨酸对膈肌的保护膈肌沿肌肉纹理分为三部分：一部分称取适量湿组织机制。生理盐水(W／V=1：10)制成10％匀浆，于低温冷冻离心机10000r／rain离心15min，分离上清液低温保存1材料与方法备用。一部分固定于4％中性甲醛中，用石蜡包埋，一1．1材料SD雄性大鼠24只，鼠龄4～8周，体重部分制作成1mtn

5、肌肉块置于4％戊二醛中固定。180～250g(辽宁医学院动物实验中心提供)，大前门1．2．3膈肌组织超微结构观察将经过4％戊二醛香烟(上海卷烟厂，焦油量15mg，烟碱量1．1mg)，N一固定的1mnl膈肌组织漂洗，2％四氧化锇固定2h乙酰半胱氨酸(德国，Ruibio公司)，脂多糖(LPS，美后，再漂洗，丙酮梯度脱水，包埋，聚合；超薄切片国，Sigma公司)，兔抗泛素蛋白抗体(北京博奥森生物(厚0．1m)，醋酸铀一枸橼酸铅电子染色。用JEM技术有限公司)，MDA、SOD检测试剂盒(南京建成生一1200EX透射电镜观察各组膈肌组织超微结构变化。物工程研究所)，TUNEL试剂盒(南京凯基生

6、物发展有1．2．4膈肌组织中MDA、SOD检测取膈肌组织上限公司)。JEM一1200EX透射电镜，CIAS一1000细胞清液，SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法，MDA以改良的图像分析系统。硫代巴比妥酸法，严格按照试剂盒说明书操作。1．2方法1．2．5免疫组化法检测膈肌组织中泛素蛋白表达1．2．1动物分组及模型制作采用随机数字表法将肌组织常规石蜡包埋、切片(厚度4m)、化蜡、脱蜡、24只大鼠分为3组，每组8只：(1)对照组：普通饮食制水。采用二步免疫组化法检测泛素蛋白表达水平。饲养28d，第1、14天经大鼠气道内注人生理盐水0．2每组随机选取8张切片，每张片随机选取5个视野利mL。第2～l

7、3、15—28天每天对该组大鼠用生理盐水进用CIAS一1000细胞图像分析系统比较各组泛素表达行灌胃(1mL／只)；(2)COPD模型组：参照宋一平等的平均灰度值。方法，采用气管内注入脂多糖加烟熏法制作大鼠1．2．6原位末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端COPD模型。第1、14天于气管内注入LPS各200g；标记法(TUNEL法)检测膈肌细胞凋亡指数(AI)每第2—13、15—28天每天在50cm×50cm×70am密闭组随机选取8张切片，每张片随机选取5