自噬及凋亡相关蛋白在PC12细胞缺糖缺氧过程中的表达及其意义.doc

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1、自噬及凋亡相关蛋白在PC12细胞缺糖缺氧过程中的表达及其意义作者：缪春明张勇王伟伟项喜艳刘菲康劲松李洪岩罗琪【摘要】目的探讨自噬及凋亡相关蛋白在PC12细胞缺糖缺氧(OGD)过程中的表达及其意义。方法将PC12细胞分为正常对照组、缺糖缺氧1、4和12h组。MTT法检测细胞存活率，Western印迹法检测各组PC12细胞中BECN1.Bel2及Bax蛋白的表达水平。结果与正常对照组相比，OGD1及4h组PC12细胞存活率下降(均P<0.05),BECN1蛋白表达升高，且Bel2/Bax比值升高；而与缺糖缺氧1和4h组相

2、比，OGD12h组细胞存活率明显下降(P<O.01),BECN1蛋白表达及Bel2/Bax比值亦明显降低。结论自噬蛋白BECN1及凋亡相关蛋白Bel2、Bax参与了PC12细胞OGD损伤过程。在OGD早期，自噬起主要作用，并对OGDPC12细胞起一定的保护作用，随着OGD时间的延长，凋亡在其中占主导地位，促进凋亡蛋白表达，引起PC12细胞的死亡。【关键词】自噬；凋亡；缺糖缺氧；PC12;BECN1;Bel2;Bax细胞缺糖缺氧(oxygenglucosedeprivation,OGD)损伤是多种临床上常见的缺血性损伤

3、（如脑缺血、心肌缺血）的病理基础。尤其是脑组织缺血时，由于其高能耗低能储的能量代谢特点，一旦组织缺血、缺氧，神经细胞首先出现能量代谢障碍，引发一系列的细胞结构和功能上的改变导致神经细胞的损伤甚至死亡。目前的研究表明，脑缺血缺氧损伤不但与坏死、凋亡有关，而且还与自噬有关，但自噬在其中的作用还存在争议〔1〕。在细胞培养液中同时去除氧气和葡萄糖，即OGD模型，是体外模拟脑缺血的经典模型。肾上腺嗜鎔细胞瘤PC12细胞的OGD模型（体外缺血模型）不仅可以模拟整体水平脑缺血的许多病理生理特征，而且由于在体外可以人工严格控制实验条件，在

4、实验过程中可随时观察细胞状态以及药物作用，因而，成为研究缺血性损伤、评价神经保护药物及研究药物机制的一种重要方法〔2〕。本研究利用连二亚硫酸钠（sodiumdithionite）消除培养基中的氧同时培养基缺糖建立PC12细胞“缺血”模型，进一步探讨PC12细胞0GD损伤自噬、凋亡相关蛋白表达的分子机制，为临床治疗脑缺血疾病提供治疗靶点。1材料与方法1.1材料连二亚硫酸钠购于国药集团化学试剂有限公司，DAB和MTT购自Sigma公司，抗

5、3actin、BECN1、Bel2及Bax抗体及相应二抗均购自SantaCruz公司，B

6、ioRadProteinAssay购于BioRad公司，细胞蛋白裂解液购于Beyotime（碧云天生物技术研究所）oPCl2细胞由中国科学院上海细胞生物学研究所提供，TMEM培养基购于Hyclone公司。1.2PC120GD模型的建立及实验分组PC12细胞用含15%新生小牛血清（Gibco公司）的IMEM培养液，置C02培养箱（37°C,5%C02）培养，隔2~3d传代1次，取对数生长期细胞分组进行实验。根据文献方法〔3〕稍加改进建立0GD模型。将正常IMDM培养液（含15%的新生小牛血清）培养的PC12细胞作为正常对照组

7、；细胞用含2mmol/L连二亚硫酸钠的无糖Earle液培养的PCI2细胞作为模型组，模型组分为缺糖缺氧1、4、12h组。将培养板置于5%C02、3VC培养箱中培养相应的时间后观察并测定相关指标。1.3四甲基偶氮哇盐（MTT）法检测细胞增殖率将正常IMDM培养液（含15%的新生小牛血清）培养的PC12细胞用IMDM培养液洗细胞2次，并稀释至3x105/（111,接种于96孔培养板上，每孔100m1,作为正常对照组；细胞用含2mmol/L连二亚硫酸钠的无糖Earle液以同样方法洗涤并稀释至3xl05/ml,接种在同一块96孔培

8、养板上，每孔100M1,作为模型组，模型组分为OGD1、4、12h组。实验重复3次，每组实验中相同条件设6个平行孔。细胞活性百分比=实验组0D均值/对照组0D均值x100%。1.4Western印迹法检测BECN1、Bel2及Bax蛋白含量用细胞蛋白裂解液裂解细胞后提取细胞蛋白，BioRad法测定蛋白含量。取蛋白30yg作SDSPAGE电泳，将蛋白样本转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。转膜后，膜用5%脱脂奶粉封闭1~1.5h,PBST洗3次，加入抗BECN1、Bel2及Bax多克隆抗体，41过夜。分别加入过氧化物酶标记的相

9、应的二抗，脱色摇床摇lh,PBST洗3次，每次5min。DAB显色，凝胶成像系统成像拍照分析。同时以0actin作为内参，实验重复3次。电泳条带密度值=灰度x面积/参照物值。1.5统计学处理数据均以x±s表示，用SPSS11.0软件进行多组间AN0VA分析。2结果2.1不同时间OGD处理后对PC12细胞