活性污泥中1株产PHB丝状细菌的分离与鉴定.pdf

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1、活性污泥中1株产PHB丝状细菌的分离与鉴定马忠友，汪建飞，祝嫦巍，吴萍1(安徽科技学院，生命科学学院，安徽凤阳，233100)2(安徽科技学院，城建与环境学院，安徽凤阳，233100)摘要从污水处理厂等活性污泥样品中分离到了19株丝状细菌，通过苏丹黑染色法和紫外吸收光谱扫描技术证明这些丝状细菌能够在菌体内积累聚B一羟基丁酸(PHB)。采用氯仿乙醇法提取PHB，并采用紫外吸收法进行定量测定，筛选出1株高产PHB丝状细菌HY10，细胞PHB含量为(37．24±0．74)％，PHB产量为1．15±0．06g／L。

2、综合该菌株的菌落形态和16SrDNA序列(GenBankNo．JQ353768)分析结果将HY10菌株鉴定为假蕈状芽孢杆菌(Bacilluspseudomycoides)。．关键词聚B．羟基丁酸，丝状细菌，假蕈状芽孢杆菌随着塑料制品的广泛使用，废弃的化学塑料由于一方面又使污泥得到了合理利用。本研究采用低营不能被微生物分解，带来了严重的“白色污染”。聚养培养基，通过富集培养和紫外吸收光谱测定技术，B．羟基丁酸(PHB)是细菌细胞内积累的一种能被微从活性污泥中分离、筛选到了1株高产PHB丝状细生物酶所降解的高分

3、子聚合物。PHB的性质与目前菌，并通过16SrDNA测序技术对该菌株进行了分类普遍使用的合成塑料有许多相似之处，例如可压塑、鉴定。成膜和拉丝等，此外，它还具有生物可降解性和生物1材料与方法相容性等优点，在医学尤其在组织工程上，具有重要的作用。因此，PHB作为一种新型的塑料替代品以1．1实验材料及生物医学材料，已经成为人们的研究热点。1．1．1样品来源Lemoigne于1926年首先在巨大芽孢杆菌(Baillus蚌埠市第一污水处理厂活性污泥、安徽科技学院megatheriucm)细胞中发现PHB，能产生PHB

4、的微生校内排水沟污泥、凤阳城区居民排水沟污泥和面粉厂物分布极广，包括光能和化能自养及异养菌，共65个排污处污泥。属中的近300种微生物。目前研究得较多用于合成1．1．2实验药品PHB的微生物有：产碱杆菌属(Alcaligenes)，假单胞聚B一羟基丁酸标准品(美国，Sigma—aldrich)，其菌属(Pseudonomas)，甲基营养菌(Methylotrophs)，固他实验药品均为国产分析纯。氮菌属(Azotobacter)和红螺菌属(Rhodospirillum)等，1．2实验方法它们能分别利用不同的

5、碳源合成不同的PHAs。其中1．2．1培养基以真养产碱杆菌的研究最多，也最成熟，已经能够小尿素富集培养基(g／L)：尿素0．5，葡萄糖1．0，规模工业化生产PHB和PHB~。MgSO·7H2O0．05，K2HPO0．1，自来水定容至1L，丝状细菌主要分布在水生环境、潮湿土壤和活性pH7．0～7．2，115℃灭菌30min。污泥中，该类细菌能在胞内积累含量较高的PHB颗Stoke分离纯化培养基(g／L)：葡萄糖1．0，蛋白粒，而且它们对污水中的有机物和有毒物质有很强的胨1．0，MgSO·7HO0．2，CaC1

6、20．05，FeC130．O1，自降解能力，在污水处理过程中发挥着重要的作用。来水定容至1L，pH7．0—7．2，琼脂20，115℃灭菌30min[如果能以工厂污水为原料，利用丝状细菌来生产。PHB，一方面将有可能大大降低PHB的生产成本，另产PHB基础发酵培养基(g／L)：葡萄糖10，蛋白胨3，MgSO4·7H2O0．2，CaC120．05，FeC130．O1，第一作者：博士，讲师(汪建飞教授为通讯作者)。K2HPO40．04，KH2PO40．03，NaH2PO4·2H2O0．05，国家自然科学基金(31

7、100070)；安徽科技学院稳定人才基金(2RC2011299)；安徽科技学院生物学重点建设学科HBO0．005，蒸馏水定容至1L，pH7．0，分装至(AKXK20102—1)；安徽农业科技成果转化基金(10140306017)250mL三角瓶中，每瓶50mL，115℃灭菌30rain。收稿日期：2012一O1—07，改回日期：2012—02—021．2．2显微染色观察笙差塑鲞蔓曼塑(星差塑!l101FOODANDFERMENTAT10NINDUSTRIES按常规制成涂片，以0．3％苏丹黑B染色10min，

8、水冲去染剂，用滤纸吸将水吸干，再用二甲苯冲洗至无色素，然后用0．5％番红复染1min，水洗，吸干，镜检。PHB颗粒染成黑绿色，菌体其他部分呈红色。1．2．3产PHB丝状细菌的分离、纯化取活性污泥5g接种于100mL已灭菌的富集培养液(尿素培养基)中，3Occ摇床培养1天，再静止培养1天。待长出漂浮于液体中的半透明絮状物时，挑图1PHB的标准曲线取絮状物，经苏丹黑染色显微镜镜检有PHB颗粒后，1．2．6产PHB丝状