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《临床医学毕业论文sirnaid1对人肝癌细胞hepg2中erk信号通路的影响.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、XX大学毕业论文siRNAID1对人肝癌细胞HepG2中ERK信号通路的影姓名：2014年6月25日siRNAID1对人肝癌细胞HtpG2中ERK信号通路的影响【摘要】H的观察siRNAID1转染人肝癌细胞HepG2细胞后对肝癌细胞系HcpG2细胞增殖的影响及其对ERK1/2通路的作用。方法实验分为4组，即空白对照组、转染试剂组、转染对照组及转染siRNAID1组。阳离子脂质体法介导siID1转染肝癌细胞后，呼蓝比色法(MTT)观察HepG2细胞增殖情况。分别用反转录聚合稱链式反应法(RTPCR)和蛋白免疫印迹法(Westernblotting)检测转染后pERK1/2.ERK1/2mRN
2、A与蛋白表达的情况。结果转染siRNAID1的HcpG2细胞增殖速度明显减慢(P0.01)。转染后ERK1/2及pERK1/2mRNA表达降低(P0.01);pERK1/2蛋白的表达较空白对照组明显降低(P0.05),ERK1/2蛋白表达空白变化不明显。结论siRNAID1转染HepG2细胞后可明显抑制细胞的增殖，使得ERK1/2基因表达活性下降，提示ID1有可能通过ERK1/2信号转导通路介导,促进肝细胞癌HepG2细胞的增殖。【关键词】抑制因子，免疫；丝裂原激活蛋白激酶类；细胞外信号调节MAP激酶类；肝肿瘤；转染；信号传导；氮蓝四卩坐;RNA,小分子干扰近期发现，丝裂原活化蛋白激酶(m
3、itogenactivatedproteinkinase,MAPK)信号途径的激活可能是DNA结合抑制因子1(inhibitorofdifferentiation/DNAbinding1,ID1)诱导细胞增殖的一个机制［1］。与正常组织相比较，肝癌组织屮的MAPK通路上的细胞外调节蛋白激iW(extracellularregulatedproteinkinase,ERK)都是处于高表达及高活性状态。若使用其ERK抑制剂就可以减缓细胞的增殖及引起细胞的凋亡［2］。本研究通过小分子干扰RNA技术使ID1基因沉默，观察其对HcpG2细胞增殖的影响及其对ERK1/2mRNA及蛋白表达的影响，探讨E
4、RK1/2及其信号转导途径与肝癌发生发展的关系。1材料和方法1.1材料人肝癌细胞株HcpG2细胞（上海科学院细胞屮心）;siRNA试剂（广州锐博生物有限公司）;四甲基偶氮卩坐蓝（MTT,厦门泰京生物有限公司）;逆转录聚合酶链反应（RTPCR）试剂盒（美国Fermentas公司）;PCR引物由上海鼎安生物科技有限公司合成;兔抗人ERK1/2多克隆抗体，兔抗人pERK1/2多克隆抗体，辣根过氧化酶（HRP）标记的羊抗兔IgG（美国SantaCruz公司）。1.2分组分为4组，即空白对照组（正常培养HcpG2细胞组）;转染试剂组（即仅加入Lipofectamine2000组;转染对照组（即转染非
5、特界性序列controlsiRNA组）;转染siRNAID1组。1.3方法1.3」siRNA的设计和合成siRNAID1由广州市锐博生物科技有限公司设计合成。靶序列：5'TGAGCAAGGTGGAGATTCT3'正义链：5'UGAGCAAGGUGGAGAUUCUdTdT3'反义链：3'dTdTACUCGUUCCACCUCUAAGA5'1.3.2细胞的培养与转染细胞常规培养于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基，于37°C、体积分数为0.05的CO2培养箱屮培养。取对数生长期细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基（无抗生索）将消化后的HepG2细胞制备成细胞悬液;调整
6、细胞浓度为1X107LJ,接种于细胞培养板内（6孔加入2mL,每孔2x104细胞），培养24h。参照说明书建议，将siRNA浓度稀释为50nmmol/L,阳离子脂质体法介导siRNAID1转染肝癌细胞。存放24h后备检测。1.3.3MTT法测定细胞增殖将对数生长期细胞接种于96孔板，每组设4个复孔，分别于培养24,48,72,96h后;每孔加入20pLMTT（5g/L）,继续培养4h。弃去上清，每孔加二甲基亚M（DMSO）150gL,平板摇床震摇10min,酶联免疫检测仪测定490nm处的吸光度（OD值）。细胞增殖抑制率=（空口对照组OD值■实验组OD值）/空白对照组OD值1.3.3RTP
7、CR检测ERK1/2及pERK1/2mRNA的表达水平用Trizol提取总RNA,反转录成cDNA。（1）内对照卩肌动蛋白（卩actin）,扩增片段556bp;循环条件：4°C预变性5min,扩增94°C30s->57°C30s—72°C45s,30个循环，最终延仲72°C7min。上游:5'AAAGACCTGTACGCCAACACAG3'下游：5,TTTTAGGATGGCAAGGGACTTC3'(2)ERKl/2扩增片
