稳定表达人血红素加氧酶-1细胞系的建立及其功能鉴定-论文.pdf

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1、中国医学科学院学报ACTAACADEMIAEMEDICINAESINICAE·论著·稳定表达人血红素加氧酶-1细胞系的建立及其功能鉴定杨根欢，吴为，李砚川，倪冷，王占启，宋希涛，刘昌伟中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院血管外科，北京100730中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京100005通信作者：刘昌伟电话：010—69152501，电子邮件：liucw@vip．sina．eom摘要：目的构建稳定表达人血红素加氧酶．1(HO．1)的细胞系，探讨内源性过表达HO．1对抗

2、细胞氧化损伤的作用。方法PCR扩增HO一1基因并将其克隆至改造的慢病毒载体pLentiLox3．7中，构建携带目的基因的重组质粒。用重组质粒转染HEK293T细胞，并用Westernblot检测HO一1的表达。将重组质粒与慢病毒辅助质粒(plpl、plp2、VSVG)共同转染HEK293T细胞，包装有活力的慢病毒。用携带HO．1的慢病毒感染HEK293T细胞，筛选出能稳定表达目的基因的单克隆，并行Westernblot检测HO-1的表达。将过氧化氢加入正常的及过表达HO．1的HEK293T细胞和人脐静脉内皮细胞，检测

3、细胞内活性氧的含量。结果成功筛选出能稳定表达HO．1的单克隆细胞系并扩大培养，Westernblot检测其HO-1的表达明显升高。加入过氧化氢后，过表达HO-1的HEK293T细胞和人脐静脉内皮细胞内的活性氧明显减少。结论成功构建了能稳定表达人HO-1的细胞系，内源性过表达HO一1能够对抗细胞的氧化损伤。关键词：血红素加氧酶一1；慢病毒；稳定细胞株；氧化损伤中图分类号：R34文献标志码：A文章编号：1000—503X(2014)04．0420-06D0I：10．388l／j．issn．1000—503X．2014．0

4、4．013EstablishmentandFunctionalIdentificationofAStableCellLineOVerexpressiOnHemeOxygenase一1YANGGen．huan，WUWei，LIYan—chuan，NILeng，WANGZhan．qi，SONGXi—tao，LIUChang—weiDepartmentofVascularSurgery，PUMCHospital，CAMSandPUMC，Beijing100730，ChinaStateKeyLaboratoryofMedic

5、alMolecularBiology，InstituteofBasicMedicalSciences，CAMSandPUMC，Beijing100005，ChinaCorrespondingauthor：LIUChang-weiTel：010-69152501，E-mail：liucw@vip．sina．comABSTRACT：ObjectiveToestablishastablecelllineoverexpressionhemeoxygenase一1(HO-1)media-tedbyamodifiedlentiv

6、irussystemandidentifyitsfunction．MethodsTheHO一1genewasamplifiedbypoly—merasechainreactionandclonedintothemodifiedpLentiLox3．7expressionvectors．TherecombinantplasmidsweretransfectedintoHEK293TcellsandtheHO-1wasdetectedbyWesternblot．Therecombinantplasmidsweretran

7、sfectedintoHEK293Tcellstoproducetheviruses，withthehelpingplasmidsincludingplpl，plp2，andVSVG．HEK293TceilswereinfectedbythevirusesandthecellsthatcanexpressHO一1wereidentifiedbyWest—ernblot．ThereactiveoxygenspeciesweredetectedintheHO-1一overexpressionHEK293Tcellsand

8、thenormalcellsaftertheaddingofhydrogenperoxide．Thesameexperimentwasperformedwithhumanumbilicalveinendo一基金项目：北京市自然科学基金(7122145)SupportedbytheBeijingNaturalSciencesFoundation(