生化设计实验.doc

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1、紫外分光光度法测定花生奶蛋白质含量一、实验目的建立非蛋白质类含氮物质对测定结果无干扰的乳与乳制品中蛋白质的快速测定方法。二、实验原理由于乳与乳制品的蛋白质中有游离的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故,在280nm波长处有特征的最大吸收,其吸收强度与样中蛋白质含量呈正比。利用这个特异性吸收,在280nm波长处,用1cm比色杯测得吸光度值。据此,计算出蛋白质的含量。双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物，在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色络合物，此反应即为双缩脲反应。含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应。蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与Cu2+络合成紫红色化合物。其颜色

2、深浅与蛋白质的浓度成正比，可以用比色法进行测定。双缩脲法最常用于需要快速但并不需要十分精确的测定。三、仪器与试剂1、仪器　①紫外分光光度计②石英比色皿③微波振荡器。2、试剂　①9g/L氯化钠溶液②蒸馏水③双缩脲试剂:溶解0.15g硫酸铜（CuSO4·5H2O）和0.6g酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）于50ml蒸馏水中，在搅拌下加入30ml10％氢氧化钠溶液，用水稀释到100ml，贮存于内壁涂以石蜡的瓶内。此试剂可长期保存。④标准蛋白溶液（10μg/ml）准确称取牛血清蛋白用0.0001mol/L氢氧化钠溶液配制，冰相存放备用.四、操作步骤1、　标准应用曲线的绘制:取

3、6支干净的试管，按0→5编号，然后按下表依次加入试剂，充分混匀，在室温下放置半小时，以0管为空白，在280nm波长处测定消光值（OD），以各管蛋白质含量（毫克）横坐标，OD值为坐标，画出标线。编号012345蛋白质标准液（毫升）00.20.40.60.81.0蒸馏水（毫升）1.00.80.60.40.20双缩脲试剂（毫升）4.04.04.04.04.04.02、样品测定:吸取花生饮料1.00ml置于100ml容量瓶中,加入9g/L氯化钠溶液至刻度,混匀。再从中吸取10.00ml样品溶液于100ml容量瓶中,加入9g/L氯化钠溶液至刻度,微波振荡5min,混匀。用定性滤纸过滤,弃

4、去初滤液30ml,收集滤液备用。用9g/L氯化钠溶液做空白调零,在280nm波长处,用1cm石英比色皿测得吸光度值。记录花生饮料的吸光度值,从工作曲线上查出或用计算标准回归方程计算出测定样品溶液中蛋白质含量C。