实验二 动物基因组DNA的提取.ppt

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1、实验二动物基因组DNA的提取一、实验目的1.说出提取真核生物基因组DNA的原理和步骤、现象2.熟练地进行真核生物基因组DNA的提取操作二、实验原理蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，将DNA从细胞中析出并与蛋白质、脂类和糖类等分离，再用饱和氯化钠溶液代替有机溶剂沉淀蛋白质，获得DNA三、仪器、材料及试剂1.仪器主要设备：电热恒温干燥箱（烘箱）、低温离心机、移液器（2,10,20,30,200,1000μl）、枪头、1ml离心管（灭菌）、塑料离心管架、吸头（灭菌）、高压灭菌锅、冰箱其它用品：一次性塑料手套、无粉橡胶手套、小型剪刀、小型镊子2.材料、试剂材料：鲤尾鳍组织试剂：琼脂糖（检测

2、用）、蛋白酶K、溴化乙锭（EB）（检测用）、Na2EDTA·2H2O、Trisbase碱(MW121.1)、十二烷基硫酸钠（SDS）、NaOH、氯化钠、无水乙醇、Tris-HCl、乙二胺四乙酸（EDTA）。DNA提取所需的试剂配制HOMBuffer：称取29.8gNa2EDTA·2H2O溶于700mL双蒸水中，加入12.1gTrisbase碱和5gSDS，NaOH调至pH=8.0，定容至1000mL。蛋白酶K：15mg蛋白酶K溶于1mL双蒸水，-20℃冷冻保存。4.5M氯化钠：称取263.25g氯化钠溶于700mL双蒸水中，定容至1000mL。75％乙醇：750mL的无水乙醇溶于

3、200mL的双蒸水，定容至1000mL。4℃预冷。TE缓冲液：1MTris-HCl(pH=8.0)2mL，0.5MEDTA(pH=8.0)0.2mL与97.8mL双蒸水混匀。四、实验步骤（一）动物组织材料的采集、保存(以鱼类分子材料的采集为例)鳍条通常采集各鳍条，因为尾鳍采集方便，量较大。1）剪取鳍条（注意鳍条量不要太多，过多脱水不完全，容易造成材料损坏。通常为离心管的一半就可以了）；剪取鳍条前洗净手、剪刀，不要粘附有上一尾鱼的材料，包括鲜血。2）将鳍条放入10mL离心管中；3）加入95-100%的酒精（加满）；4）依次在20min、1h、2h、5h、12h后更换酒精（后2次可依

4、具体情况更换）。5）用中性笔写上标签，编号为“地点编号年月日001”起，如020120728001，其中0（地点编号）2012（年）07（月）08（日）001（当天编号）。将标签放入离心管中。肌肉1）洗净手、剪刀，不要粘附有上一尾鱼的材料，包括鲜血。2）用剪刀去除鱼类皮肤3）剪取长条形肌肉（不要太厚，可以适当长一些，薄一些，便于脱水、固定DNA）4）将肌肉放入10mL离心管中5）加入95-100%的酒精（加满）；6）依次在20min、1h、2h、5h、12h后更换酒精（后2次可依具体情况更换）。7）用中性笔写上标签，编号为“地点编号年月日001”起，如020120728001，其

5、中0（地点编号）2012（年）07（月）08（日）001（当天编号）。将标签放入离心管中。鱼类分子样品的保存每个地方，不同鱼类材料放到不同封口袋中保存，注意防止酒精挥发。温度最好保持在4℃以下。（二）DNA提取(高盐法)取0.05-0.1g左右的尾鳍组织，充分剪碎，放入1.5mL离心管中；向离心管中加入10～15μL的蛋白酶K、500μL的HOMbuffer，在55℃消化至少2-3h，每隔0.5-1h摇动一次；加500μL氯化钠（4.5M），300μL氯仿，混5-20min，期间剧烈摇动。13000r/min下离心10min；转移上清液到新管（大概850μL左右），加595μL无

6、水异丙醇（0.7volume）,混20min，13000r/min下离心10min，倒掉上清；加500μL75％乙醇，置5min，13000r/min下离心20min，倒掉上清液；将试管倒立于吸水纸上，室温下自然干燥；加50～100μL的灭菌双蒸水或TE溶解，-20℃(4℃)保存。注意事项（1）材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低；（2）离心分离两相时，应保证一定的转速和时间；（3）沉淀后应用75％的乙醇洗涤，以除去盐离子等；（4）室温干燥DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）；（5）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解（pH值为8.0，可防止DNA发生酸解，TE中的E

7、DTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase）。五、实验安排本实验一天内可做完。第一次，约2.5h，取样与酶解。酶解完成后，以班级为单位放入1.5mL离心管盒。第二次，约4h，DNA提取。六、实验报告/作业1）蛋白酶K、75％乙醇的作用是什么？其使用量如何掌握？2）你的组织材料消化后消化液的颜色、透明度如何？是否有未消化材料？未消化材料可能是什么？3）在试验的各步骤你看到什么现象？4）叙述高盐法提取动物基因组DNA的步骤。5）生物科学专业作业：DNA的粗提取与鉴定实验是人教